糖尿病(DM)是一种以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。目前,DM患病人数逐年增多,已经引起全世界的普遍关注。因此寻找疾病早期诊断标记物和治疗靶点,对于预防和治疗DM具有重要意义。葛根是野葛或干葛藤的干燥根,在临床上常用于治疗表证发热、阴虚消渴、脾虚泄泻等症状,葛根素是葛根中含量最高的有效成分,越来越多的研究证明葛根素在改善胰岛素抵抗、消除炎症方面具有较好的效果。因此,本研究拟采用网络药理学技术构建“药物-疾病-靶点”网络关系图,获得葛根素作用于DM的相关靶点和通路,其次通过注射STZ诱导DM小鼠模型,以二甲双胍作为阳性对照,不同剂量的葛根素作为保护药,根据生理生化指标结合组织形态学对模型进行验证并探讨葛根素对DM的保护作用。利用代谢组学技术,对空白组(Control)、糖尿病组(DM)、二甲双胍组(Met)和葛根素中剂量组(Pue-M)血清中的代谢物进行分析,寻找引发DM的潜在生物标记物,探讨葛根素对DM保护的可能机制。结合Western blot和RT-PCR技术对葛根素保护DM的可能机制进行验证。通过构建IR-HepG2细胞模型,从细胞水平上对葛根素保护DM的作用机制进行进一步验证。为临床上DM的诊断和治疗提供数据参考。主要研究内容如下:1.基于网络药理学研究葛根素治疗糖尿病的作用机制通过数据库共筛选到葛根素潜在作用靶点132个,DM作用靶点4545个,对葛根素和DM共同作用靶点进行网络可视化和PPI节点分析,发现AKT1和VEGFA是连接其他节点的核心节点,对所涉及到的节点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,获得得分较高的信号通路为PI3K-AKT、MAPK、TNF等,其中所涉及到的相关蛋白基因主要有PI3K、AKT、NF-κB、mTOR 等。2.糖尿病小鼠模型的构建以及葛根素保护效果的研究60只SPF级雄性小鼠适应性喂养一周后,腹腔注射STZ诱导DM小鼠模型,经生理生化指标和组织形态学验证模型构建成功并探讨葛根素的保护效果。结果表明,与Control组比较,DM组小鼠血糖显著升高(p<0.01),饮水、饮食和尿液增多,体重持续下降,符合糖尿病“三多一少”的临床特征;此外,DM组小鼠对葡萄糖的耐受力显著下降(p<0.001),胰岛素含量和胰岛素抵抗系数显著升高(p<0.01)。生化指标结果显示,与Control组比较,DM组小鼠TG、TC、LDL显著升高(p<0.01或p<0.001),HDL显著下降(p<0.01);氧化指标结果显示,DM组小鼠MDA含量升高(p<0.01),SOD活力下降。灌胃二甲双胍和葛根素后,DM小鼠症状改善,体重趋于正常,血糖降低,糖耐量改善,胰岛素抵抗系数显著降低(p<0.001),血清四脂与DM组比较明显改善,肝脏中MDA含量显著下降(p<0.05),SOD活力升高。组织形态学结果显示,Control组小鼠肝脏组织完整,细胞排列整齐,未见炎症浸润;胰脏中,胰岛数目多,边缘平滑,胞浆丰富。DM组小鼠肝脏细胞出现脂肪空泡,多炎症浸润;胰脏中,胰岛形状不规则且边缘界限模糊,胰岛细胞数目少,胞浆流失。二甲双胍和葛根素保护后,肝细胞炎症浸润现象减轻;胰脏中胰岛形态趋于正常,胰岛数目增多,少见空泡。以上结果显示,STZ诱导的DM小鼠发生糖脂代谢紊乱,产生氧化应激,并且对肝脏和胰脏造成了损伤,而二甲双胍和葛根素对DM小鼠具有一定的保护作用,其中中剂量效果最佳。3.基于代谢组学研究葛根素对糖尿病的保护作用采用UPLC-Q-TOF对Control组、DM组、Met组以及Pue-M组小鼠血清中的代谢物进行分析,结果显示,各组小鼠血清样品实现完全分离,且组内聚集度较好。对差异代谢物进行代谢通路分析,主要涉及的代谢通路有甘油磷脂代谢通路和戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化,分析主要代谢物,结果提示DM的发生以及葛根素对DM的保护作用可能与糖脂代谢和炎症因子密切相关。4.基于AMPK/mTOR和PPARγ/NF-κB信号通路研究葛根素对糖尿病的保护作用与Control组比较,DM组小鼠AMPK和PPARγ蛋白和mRNA表达下调(p<0.01或p<0.001),mTOR和NF-κB蛋白和mRNA表达上调(p<0.01或p<0.001),二甲双胍和葛根素保护后,以上蛋白的表达量趋于正常。提示葛根素可以通过激活AMPK从而抑制mTOR的表达,改善胰岛素信号转导和糖脂代谢过程;此外,葛根素能够通过激活PPARγ从而抑制NF-κB活性,抑制DM小鼠的炎症反应,从而发挥对DM小鼠的保护作用。5.通过构建IR-HepG2细胞模型验证葛根素对糖尿病的保护作用为进一步评估葛根素对DM以及胰岛素抵抗的作用及机制,开展体外研究,采用高浓度胰岛素诱导IR-HepG2细胞,观察葛根素对IR-HepG2细胞的影响,并探讨其分子机制。结果显示,与Control组比较,高浓度的胰岛素会影响HepG2细胞对葡萄糖的消耗,造成细胞中胰岛素、TG、ROS和MDA含量升高(p<0.01或p<0.001),SOD活力下降;破坏细胞结构,加速细胞凋亡。二甲双胍和葛根素保护后,IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗升高,胰岛素和TG含量下降,氧化指标改善,细胞形态有所改善,凋亡率下降。此外,与Control组比较,IR组细胞中AMPK和PPARy蛋白和 mRNA 表达下调(p<0.05 或 p<0.01),mTOR 和 NF-κB 蛋白和 mRNA表达上调(p<0.05或p<0.01或p<0.001);与IR组比较,Met组和葛根素各剂量组中蛋白和mRNA表达趋于正常。以上结果提示,葛根素能够在生理生化水平上改善IR-HepG2细胞的胰岛素抵抗;并且进一步从细胞水平验证了葛根素能够改善AMPK/mTOR和PPARy/NF-κB信号通路,从而改善肝脏糖脂代谢异常和胰岛素抵抗,降低炎症损伤。