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目的： 中药蛇六谷，又名魔芋，为天南星科魔芋属多年生草本植物的块茎，为中医临床常用的抗肿瘤中药。魔芋葡甘露聚糖(KGM)的含量约占蛇六谷50%～60%，是其主要的有效成分之一，尤其在其抗肿瘤的作用方面。故以KGM在动物水平的抗肿瘤研究为基础，进行 KGM 在免疫调节作用方面的相关研究。本实验以KGM为研究对象，利用细胞和分子生物学技术，并以小鼠巨噬RAW264.7细胞和小鼠肝癌细胞HepA为靶细胞，深入探讨 KGM 免疫抗肿瘤活性的作用机制。 方法： (1) MTT法检测KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞和小鼠癌细胞HepA存活率的影响，确定KGM浓度50-200 ug/mL抗肿瘤效果明显，且对巨噬细胞RAW264.7形态学的变化进行观察；再采用吞噬中性红和流式细胞仪测FITC-dextran的方法检测KGM处理后小鼠巨噬RAW264.7细胞的吞噬活性； (2) Griess法测定NO； (3) Transwell小室建立小鼠巨噬RAW264.7细胞与小鼠肝癌细胞HepA体外非接触式共培养模型； (4) ELISA试剂盒检测细胞培养液中的IL-6、IL-1β 和TNF-α 等细胞因子的含量； (5) 流式Annexin V-FITC/PI 双染法定量测定HepA细胞的调亡率。 (6)qRT-PCR法从mRNA水平检测小鼠巨噬细胞RAW264.7相关基因 (iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM、NF-κB)；以及与巨噬细胞RAW264.7共培养后，癌细胞凋亡相关基因 (p53、bax、bcl-2、Caspase3和Caspase9) 的表达水平； (7) Western blotting法从蛋白水平验证KGM对小鼠巨噬RAW264.7细胞免疫调控信号通路蛋白(NF-κB、NF-κBp65、TLR4、MyD88、TRAF6) 和共培养后HepA细胞凋亡通路相关蛋白(p53、Cytochromec、bax、bcl-2、Caspase9和Caspase3）的表达。 结果： (1)经 MTT法检测发现KGM在50-400μg/mL剂量范围内对小鼠巨噬RAW264.7细胞和肝癌细胞HepA细胞没有任何细胞毒性。在50-200μg/mL 共培养24 h后对HepA细胞的诱导凋亡作用最明显。 (2)对照组巨噬细胞RAW264.7多数呈圆形，少数呈梭形。经KGM处理24 h后，细胞形态改变，KGM处理组RAW264.7细胞体积增大，胞内颗粒小泡增多，呈不规则多边形，部分细胞伸出伪足，表现为典型的激活态。 (3)经中性红吞噬实验和流式测定FITC-dextran实验结果发现50-200μg/mL KGM能显著提升小鼠巨噬RAW264.7细胞的吞噬活性，与对照组相比，100μg/mL KGM分别可以使细胞吞噬活性提高101.4%和404.3%。 (4)经Griess试剂法检测发现KGM能显著增加小鼠巨噬细胞RAW264.7合成和释放NO的量，其中100μg/mL KGM处理组细胞的NO含量与1μg/mL LPS作用时相当，与对照组相比NO量提高318.1%。 (5)经ELISA检测发现50-200μg/mL KGM 能诱导RAW264.7细胞分泌IL-6 、TNF-α 和IL-1β 等细胞因子，与对照组相比，100μg/mL KGM明显可以使细胞因子分泌量分别增加415.5%、158.6% 和458.0%(P<0.05)。且在共培养体系中KGM更加显著地促进了TNF-α 的分泌量 (6) qRT-PCR的结果显示，相比于Control组，KGM组的IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β、TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB的mRNA表达水平升高(P<0.05)；TRAM的mRNA表达水平无显著性改变。 (7)Western blotting 结果显示KGM可以明显促使 TLR4、MyD88、TRAF6和pNF-κB的蛋白表达量(P<0.05)，这些结果表明KGM可以激活小鼠巨噬RAW264.7细胞中的核转录因子NF-κB和TLR4。 (8) 共培养后对KGM对HepA细胞的间接抑制率较高，具有显著性差异(P<0.05)；AnnexinV-FITC/PI流式测定细胞凋亡率升高，具有显著性差异(P<0.05)，说明KGM通过共培养可以诱导癌细胞的凋亡；进一步通过Western blot分析，细胞内 p53、Bax、Cytochrome c、Caspase3和Caspase9的蛋白表达量均升高，而bcl-2的蛋白表达量与对照组比较明显下降，均有显著性差异(P<0.05)。利用qRT-PCR技术，从基因水平上可得出如下结论：p53、bax、Caspase3、Caspase9表达量显著升高(P<0.01)，Bcl-2含量显著降低(P<0.01)，与Western blot结果一致。 结论： (1)KGM 对小鼠巨噬RAW264.7细胞具有免疫调节活性。KGM 能够对小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力显著提升，并促进RAW264.7细胞分泌与释放NO和相关细胞因子(IL-6 、TNF-α 和 IL-1β)。 (2)TLR4是KGM 激活小鼠巨噬RAW264.7细胞的主要受体；且推测KGM 可能通过激活TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路发挥免疫调节作用。 (3)KGM 通过与巨噬细胞RAW264.7 的共培养，可以显著地诱导癌细胞的凋亡。 (4)在共培养体系中KGM 对TNF-α 的分泌量。 (5)KGM可通过激活 p53/Bax/caspase 3线粒体依赖性途径诱导 HepA细胞凋亡。综上所述， KGM很可能通过 TLR4介的 MyD88依赖性信号通路发挥体内外的免疫调控和抗肿瘤作用，为蛇六谷的临床合理使用提供了有力依据。