【摘 要】
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目的:建立运用不同CRISPR/Cas9技术构建遗传性疾病细胞模型的方法,并以TNFAIP3/A20基因突变作为基因编辑的靶点,构建表达TNFAIP3:c.1428G>A错义突变的细胞模型。以突变携带者来源的人B淋巴细胞系（Lymphoblastoid B cell line,LCL）作为基质型,通过构建的细胞模型初步探究免疫缺陷疾病基因TNFAIP3/A20突变的功能。方法:通过直接在细胞基因组
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目的:建立运用不同CRISPR/Cas9技术构建遗传性疾病细胞模型的方法,并以TNFAIP3/A20基因突变作为基因编辑的靶点,构建表达TNFAIP3:c.1428G>A错义突变的细胞模型。以突变携带者来源的人B淋巴细胞系（Lymphoblastoid B cell line,LCL）作为基质型,通过构建的细胞模型初步探究免疫缺陷疾病基因TNFAIP3/A20突变的功能。方法:通过直接在细胞基因组DNA引入目的突变,以及目的基因TNFAIP3敲除后突变型基因高表达两种策略,构建表达TNFAIP3:c.1428G>A突变的细胞模型。（1）采用PE（prime editing）先导编辑器在HEK293T细胞基因组中引入TNFAIP3:c.1428G>A突变。通过PE编辑的阳性位点RNF2:c.G82A评估不同PE编辑系统的效率。针对目标位点设计和合成sgRNA 靶向序列、pegRNA靶向序列及3’端延伸序列,并据此构建gRNA表达质粒。现有的PE3-GFP编辑系统进行改造,替换GFP元件为Puro元件,构建重组编辑系统PE3-Puro。sgRNA、pegRNA和PE表达质粒共转染至HEK293T细胞进行碱基替换。采用PCR-Topo克隆测序及全外显子测序技术检测编辑效率,通过有限稀释法挑选突变的单克隆细胞株。（2）采用基于CRISPR/Cas9的CBE编辑器或NHEJ修复途径对Hela细胞进行TNFAIP3基因敲除,构建突变型和野生型蛋白表达载体进行表达调控。根据CBE编辑框在TNFAIP3基因序列上寻找可引入终止密码子的靶点,设计相应sgRNA并构建表达载体,与BE4质粒共转染至Hela细胞,再通过嘌呤霉素筛选阳性细胞。针对TNFAIP3基因序列设计和合成两组候选sgRNA引导敲除序列,构建pX330-mCherry-TNFAIP3敲除质粒并转染至Hela细胞,流式细胞术分选阳性细胞。采用有限稀释法挑选基因敲除的单克隆细胞株,PCR-Topo克隆测序检测DNA突变,蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测蛋白敲除情况。采用RT-PCR从携带者来源的LCL细胞中获得TNFAIP3基因CDS序列,构建蛋白表达载体。（3）对免疫缺陷病患者来源的LCL细胞以及构建的两种细胞模型进行LPS刺激,RT-qPCR检测TNFAIP3、TNF-α、RELA和IL-6基因的RNA表达水平,WB检测TNFAIP3/A20蛋白表达水平,对比野生型与突变型的差异。结果:（1）患者来源的LCL细胞未受LPS刺激时TNFAIP3、TNF-α和IL-6基因RNA表达低于正常LCL,LPS刺激后TNFAIP3/A20蛋白水平低于正常LCL。（2）采用PE3对RNF2:c.82G>A进行编辑的效率为30%,而使用PE3-Puro时编辑效率提高至100%。PE3-Puro引入TNFAIP3:c.1428G>A的编辑效率为18.58%。获得TNFAIP3:c.1428G>A杂合突变的HEK293T细胞株,与正常HEK293T相比,未见TNFAIP3、TNF-α、RELA和IL-6等分子的表达差异。（3）NHEJ重组获得3株TNFIP3基因敲除成功的Hela细胞株,DNA和蛋白水平均显示TNFAIP3翻译终止。突变型和野生型蛋白表达调控对TNF-α、RELA和IL-6表达水平的影响无明显差异。结论:（1）构建了TNFAIP3:c.1428G>A杂合突变的HEK293T细胞模型,以及TNFAIP3基因敲除后突变型基因过表达的Hela细胞模型,为该突变的功能验证提供了细胞基础。（2）在患者来源的LCL细胞与基于CRIPSR/Cas9构建的细胞模型中,TNFAIP3突变功能分析结果有所差异,不同细胞与免疫缺陷型疾病之间的联系还需进一步探讨。
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