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骨发生包括骨组织形成(bone formation)和骨组织吸收(bone resorption)两个基本过程。骨形成后,人的一生均通过骨形成和骨吸收构成的骨重建(boneremodeling)过程保持骨的更新。其中,骨形成由成骨细胞调控,骨吸收则由破骨细胞调控。骨代谢稳态依赖于这两种细胞之间的耦联平衡和精确调控,此平衡一旦被打破,将会导致以骨质疏松为代表的多种骨代谢疾病的发生。
NRAGE(neurotrophin receptor—interacting MAGE homolog)又称之为MAGE-D1或Dlxin-1,是MAGE家族的一员。关于该基因的功能研究前期多集中在细胞凋亡、细胞周期和细胞分化等方面。目前尚未有关于NRAGE与骨发育或骨代谢关系的报道。但是通过相关领域的文献分析,我们推测:NRAGE可能与骨骼发育和骨代谢调控存在相关性。NRAGE基因的表达图谱提示,该基因在附肢骨和头盖骨中表达丰富；原位杂交实验也表明,在指/趾形成过程中,该基因在软骨雏形周围细胞层中强表达。另外,NRAGE可以与Dlx5、Msx2、Ror2及Rorα等结合,而这些受体或转录因子均已证明在骨发育或骨代谢过程中发挥重要作用。除此之外,NRAGE可以影响NF-κB的活性,NF-κB家族的p50,p52亚基同时敲除的小鼠,破骨细胞分化受阻,表现出严重的骨质硬化症。鉴于上述分析,本课题利用NRAGE基因敲除小鼠为模型,通过体内外实验探讨NRAGE对骨代谢的调控作用,并初步进行了可能的机制探讨。主要内容包括两部分:1.明确NRAGE对骨代谢的调控作用；2.探讨NRAGE对破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能的影响及其可能涉及的分子机制。
主要实验内容及方法如下:
第一部分:基于NRAGE基因敲除小鼠,明确NRAGE对骨代谢的调控作用1)利用X-射线摄像,并结合小鼠后肢股骨和胫骨长度的比较,分析NRAGE基因敲除后对骨形态的影响；
2)分离10周龄和16月龄NRAGE基因敲除小鼠和野生型小鼠的股骨,通过小动物活体成像系统中X光机和双能X线吸收测量仪(DXA)检测小鼠股骨骨密度变化；
3)利用Micro-CT技术检测16月龄NRAGE基因敲除和野生型小鼠的股骨超微结构的变化；
4)通过三点弯曲实验检测NRAGE基因敲除后小鼠股骨生物力学的改变。
第二部分:探讨NRAGE对破骨细胞的分化成熟和骨吸收功能的影响及其可能涉及的分子机制1)分离16月龄敲除小鼠和野生小鼠股骨,脱钙后进行常规石蜡切片制备,然后进行破骨细胞标志酶抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色,从组织水平检测NRAGE对破骨细胞的影响；
2)分离10周龄敲除小鼠和野生型小鼠的骨髓单核细胞,利用M-CSF和RANKL进行破骨细胞的诱导分化和骨吸收实验,通过破骨细胞TRAP染色计算破骨细胞面积,甲苯胺蓝染色以及扫描电镜观察骨吸收陷窝,来检测破骨细胞分化和骨吸收活性；提取诱导培养8d的破骨细胞RNA,采用qPCR,检测破骨细胞标志性因子TRAP、CTR和cathepsinK的表达水平；
3)分离10周龄NRAGE基因敲除小鼠和野生型小鼠的骨髓单核细胞,利用M-CSF和RANKL进行破骨细胞的诱导分化,提取诱导时间为0min,5min,15min和30min的破骨细胞总蛋白,通过检测NF-κB信号通路中的核心蛋白IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平,判断NRAGE对破骨细胞的影响是否通过NF-κB信号通路来实现。
主要实验结果:
第一部分:NRAGE基因敲除导致了小鼠骨质疏松的发生X-射线摄像、小鼠后肢骨长度分析表明,NRAGE基因敲除小鼠骨形态正常；但是骨密度检测发现,NRAGE基因敲除小鼠的骨密度明显低于野生型小鼠(P<0.01)。Micro-CT分析显示,NRAGE基因敲除小鼠股骨松质骨骨密度和骨矿物含量明显减少(P<0.01),骨表面积和体积比升高(P<0.01),骨体积分数下降(P<0.05),同时骨小梁的数量减少,连接度降低,厚度减小,骨小梁间隙增大,结构形态杆状化,其超微结构发生了退行性变化,出现了明显的骨质疏松的表型。
第二部:NRAGE基因敲除促进了破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性组织切片TRAP显色表明,NRAGE基因敲除小鼠破骨细胞数目和活性明显增强；体外破骨细胞M-CSF和RANKL诱导分化实验发现,NRAGE基因敲除导致破骨细胞数量显著增多(P<0.01),体积显著增大(P<0.01),骨片上骨吸收陷窝多且面积大(P<0.01)。分子水平检测发现,NRAGE基因敲除小鼠的破骨细胞标志性基因TRAP、CTR和cathepsinK的表达显著升高(分别为P<0.01、P<0.05和P<0.05)。上述结果提示:NRAGE基因敲除促进了破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性。对体外诱导培养的破骨细胞在不同的时间点提取蛋白,发现诱导时间5min时,NF-κB信号通路中的IKK、IκB和NF-κB的磷酸化水平达到最高峰,且NRAGE基因敲除组高于野生型组。
主要结论:
1.NRAGE基因敲除导致小鼠发生了骨代谢紊乱；
2.NRAGE基因敲除促进了破骨细胞的分化成熟和骨吸收活性。