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背景:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种以肝细胞脂肪空泡变性和脂肪过度堆积为特征,且无大量饮酒史的临床综合征;表现为不同程度的肝脏病变,从单纯的脂质沉积至肝炎、肝纤维化、甚至肝硬化的严重炎症反应。目前临床上仍缺乏有效的治疗措施,所以急需新型药物的开发。人参皂苷Rg1是从人参中提取的一种活性成分,近年来被广泛报道在各类肝脏疾病中起保护作用,包括酒精性肝炎、急性肝衰竭、非酒精性脂肪肝等。我们课题组前期研究证实人参皂苷Rg1在高脂诱导的NAFLD小鼠体内能通过提高氧化酶的活性、促进脂肪酸?-氧化来改善脂质过氧化,通过抑制炎症小体的活化来减轻肝脏炎症;但Rg1对NAFLD发生起点脂质沉积环节的作用以及在后续更加严重的炎症反应中可能的直接作用靶点尚未十分清楚。因此,本研究采用棕榈酸诱导的HepG2细胞作为NAFLD细胞脂质沉积以及炎症模型,在体外系统评估Rg1抗脂质沉积与抗炎的作用,并探索其可能的分子机制。方法:1.CCK-8法:用0,0.125,0.25,0.5mM棕榈酸和0,10,20,40,80,100μg/mL不同浓度的人参皂苷Rg1培养HepG2细胞,探索其最适浓度。2.细胞模型及分组:用0.25mM棕榈酸处理HepG2细胞24小时构建非酒精性脂肪肝细胞模型,使用40μg/mL或80μg/mL Rg1培养6小时,设置对照组、模型组、Rg1低剂量组、Rg1高剂量组。用0.25mM棕榈酸处理HepG2细胞24小时,加或不加10μM AMPK抑制剂(Compound C,CC)预处理1h,再使用40μg/mL Rg1处理6小时,设置模型+抑制剂组、Rg1+抑制剂组。3.细胞内脂质沉积检测:微量法检测细胞内甘油三酯(TG)含量;油红O染色后光镜下观察脂质沉积情况,加异丙醇溶解染料后测定各组细胞吸光度。4.细胞上清炎症指标检测:全自动生化仪检测各组细胞上清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养上清炎症介质IL-6、IL-1?、TNF-?的表达。5.脂质代谢通路的检测:Western blot检测各组细胞内AMPK、pAMPK及其下游脂肪从头合成关键蛋白ACC?、p-ACC?、SREBP-1c、FAS的变化;RT-qPCR检测SREBP-1c、FAS mRNA的变化。6.炎症通路的检测:Western blot检测NF-?B P65、p-P65及其下游IL-6、IL-1?、TNF-?蛋白的变化;RT-qPCR检测IL-6、IL-1?和TNF-?mRNA的变化;免疫荧光染色观察NF-?B P65核转移,于激光共聚焦下观察。7.采用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学分析,所有数据均以均数±标准差(?x+s)表示。多组间比较采用单因素方差分析,检验标准?=0.05。结果:1.0.5mM棕榈酸以及100μg/mL人参皂苷Rg1对HepG2细胞具有明显的毒性,所以在后续的实验中我们选择使用0.25mM棕榈酸以及40、80μg/mL两个剂量。2.人参皂苷Rg1能改善肝细胞内甘油三酯的含量和脂质沉积情况:与对照组比较,模型组HepG2细胞内的甘油三酯总量明显增加。经Rg1干预后,细胞内甘油三酯含量有所下降(P<0.05),且高、低剂量之间无明显差异(P>0.05)。油红O染色结果显示,与对照组相比,模型组细胞内脂滴聚集明显增加,吸光度增加。而与模型组相比,Rg1低剂量组和Rg1高剂量组细胞内脂滴均有不同程度地降低,吸光度也降低(P<0.05)。3.人参皂苷Rg1能降低细胞培养上清炎症指标的表达:与对照组相比,模型组细胞上清的ALT、AST明显增加。低剂量或高剂量Rg1能不同程度地降低细胞上清ALT、AST的含量(P<0.05);且低、高剂量之间无明显差异(P>0.05)。ELISA结果显示,模型组细胞上清的炎症因子IL-1?、IL-6、TNF-?的表达明显高于对照组;低剂量和高剂量Rg1能不同程度地减少IL-1?、IL-6、TNF-?的释放,差异具有统计学意义(P<0.05)。除了IL-1?之外,低剂量与高剂量之间均无明显差异(P>0.05)。4.人参皂苷Rg1能增加AMPK、ACC?磷酸化,减少SREBP-1c、FAS mRNA与蛋白的表达:RT-qPCR结果显示,模型组的SREBP-1c与FAS表达较对照组明显增加;与模型组相比,低、高剂量Rg1组SREBP-1c与FAS基因的表达均不同程度地下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。且两组间没有明显差异(P>0.05)。Western blot检测AMPK通路脂质代谢相关蛋白的结果显示,与对照组相比,模型组的AMPK与ACC?磷酸化明显减少,SREBP-1c与FAS的表达明显增加;与模型组相比,不同剂量Rg1组AMPK与ACC?磷酸化均显著增加,SREBP-1c与FAS的表达均明显减少(P<0.05)。除FAS外,低、高剂量Rg1组之间各蛋白表达无明显差异,且各组间total-AMPK和total-ACC?的表达无显著性差异(P>0.05)。5.人参皂苷Rg1能减少NF-?B P65的磷酸化与核转录,下游IL-1?、IL-6、TNF-?mRNA与蛋白的表达。与对照组相比,模型组p-NF-?B P65、IL-1?、IL-6、TNF-?蛋白表达明显增加。经低剂量及高剂量Rg1干预后,p-P65、IL-1?、IL-6、TNF-?表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。各组间total-NF-?B无明显差异(P>0.05)。且与高剂量Rg1组相比,低剂量Rg1组p-NF-?B、IL-1?下降得更明显(P<0.05)。免疫荧光结果显示,对照组的NF-?B P65蛋白主要表达于细胞质内,模型组的P65大多被激活进入细胞核内,经低或高剂量Rg1处理后,可见NF-?B P65不同程度地出核进入胞质。结论:人参皂苷Rg1可以降低HepG2细胞内甘油三酯的含量以及改善细胞内脂滴的沉积,也可以减少HepG2细胞培养上清中促炎因子IL-1?、IL-6、TNF-?的释放。人参皂苷Rg1可以通过AMPK/NF-?B通路改善NAFLD细胞模型脂质沉积,并减轻其炎症反应,为非酒精性脂肪肝的治疗提供了新的思路。