论文部分内容阅读
浅蓝霉素是一类有着独特的二联吡啶环结构的天然产物,具有抗真菌和抗细菌的活性,其中的浅蓝霉素A最近还被发现具有开发成为免疫抑制剂的潜力。本研究的目的是克隆和鉴定海洋放线菌Actinoalloteichus sp.WH1-2216-6中浅蓝霉素A的生物合成基因簇,解释浅蓝霉素A的生物合成机制,并利用组合生物合成研究浅蓝霉素A的结构多样化。
浅蓝霉素A的产生菌Actinoalloteichus sp.WH1-2216-6是先前从威海沿海的海泥样品中分离得到的。本研究首先构建了Actinoalloteichus Sp.WH1-2216-6菌株的全基因组cosmid文库,包含有2100个克隆子,利用基于浅蓝霉素生物合成所必需的L-赖氨酸-2-氨基转移酶基因的保守区设计的兼并性引物,从中筛选得到了8个阳性克隆。选择其中的pCSG2016进行鸟枪法测序,获得了50590 bp的DNA序列。生物信息学分析显示,该DNA序列包含29个开放阅读框(ORFs),其中有17个可能与浅蓝霉素A的生物合成相关,包括一个羟化酶、一个O-甲基转移酶、两个氨基酸转移酶、一个加氧酶、一个AMP连接酶、一个氨基酸氧化酶、一个非核糖体肽合成酶.聚酮合成酶杂合体(NRPS-PKS)、一个非核糖体肽合成酶、一个脱氢酶、一个硫酯酶、一个酰胺水解酶、三个转运蛋白以及两个转录调节子。
同时,本研究利用整合型载体pSET152为外源DNA探索出了产生菌进行接合转移的较佳条件——13 h的孢子预萌发时间和使用含有75-100 mmol/L的MgSO4的培养基。并通过PCR-targeting技术和优化后的接合转移实验条件获得了不再生产浅蓝霉素的orf12基因(二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶)缺失的双交换突变株,从而成功建立了该菌株的遗传操作体系。这有利于后续的基因敲除实验,也为其它异壁放线菌属菌种的相关遗传研究提供了借鉴。
为研究浅蓝霉素A的生物合成途径,本论文对其中的8个关键酶基因分别进行了体内突变研究,并分析各个突变株的发酵情况。编码二氨基丁酸丙酮酸氨基转移酶的orf10基因缺失的突变株,积累了两个失去C7位的氨基的中间体,表明Orf10的功能是负责浅蓝霉素A吡啶环上C7位氨基的形成;编码O-甲基转移酶的orf9基因缺失的突变株,积累了一个吡啶环的C4位失去氧位甲基的中间体,证明了Orf9的O-甲基转移酶功能;编码单肌氨酸氧化酶的orf14基因缺失的突变株失去了生产浅蓝霉素的能力,而进行吡啶甲酸喂养后又恢复了浅蓝霉素的生产,充分说明Orf14的功能就是催化形成吡啶甲酸;编码二羟基苯甲酸甲酯AMP连接酶的orf12基因的敲除突变株不再生产浅蓝霉素,推测其有可能负责将吡啶甲酸转化为吡啶甲酸CoA酯;编码异丁胺-N-羟化酶的orf8基因的敲除突变株在保留时间较前的地方积累了新的产物,推测其有可能负责C7位氨基的羟化;orf15基因编码一个非核糖体肽合成酶.聚酮合成酶的杂合体蛋白,该基因缺失的突变株不再生产浅蓝霉素A,推测其很有可能直接参与浅蓝霉素A的二联吡啶环骨架的生物合成。另外,编码2-甲基-3-羟基吡啶-5-羧酸加氧酶的orf11基因的突变株和编码酰胺水解酶的orf20基因的突变株都仍然保留了生产浅蓝霉素A的能力,但却都不再生产浅蓝霉素D,说明这两个基因有可能与浅蓝霉素D的生物合成有关。
最后,根据生物信息学分析和体内突变的研究结果,初步推导了浅蓝霉素A的生物合成途径。本研究为进一步阐明浅蓝霉素A的完整生物合成途径,和对浅蓝霉素进行组合生物合成改造,获取新结构类似物奠定了基础。