【摘 要】
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番木瓜环斑花叶病毒（Papaya ringspot mosaic virus,PRSV）病害严重影响番木瓜的种植产业,筛选抗PRSV相关基因并对其进行功能鉴定是培育抗PRSV番木瓜品种的有效途径。利用抗PRSV的番木瓜基因资源,增强番木瓜抗PRSV能力,避免在番木瓜种植过程中造成的减产绝收,对培养抗病、增产、优质的相关品种有重要的意义。本研究对本课题组前期试验所得到的“CTS-N（Chitosan
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番木瓜环斑花叶病毒（Papaya ringspot mosaic virus,PRSV）病害严重影响番木瓜的种植产业,筛选抗PRSV相关基因并对其进行功能鉴定是培育抗PRSV番木瓜品种的有效途径。利用抗PRSV的番木瓜基因资源,增强番木瓜抗PRSV能力,避免在番木瓜种植过程中造成的减产绝收,对培养抗病、增产、优质的相关品种有重要的意义。本研究对本课题组前期试验所得到的“CTS-N（Chitosan-N）诱导番木瓜抗PRSV转录组”数据分析上调表达的两个基因CpRBOHD和CpTIFY10A-like进行cDNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA end,RACE）克隆,获得基因全长并进行生物信息学相关分析。使用实时荧光定量技术（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR）鉴定样品中CpRBOHD和CpTIFY10A-like基因表达量的变化。对目标基因进行原核表达并使用SDS-PAGE电泳验证原核表达效果。利用荧光显微镜观察烟草叶片细胞,明确CpRBOHD和CpTIFY10A-like基因亚细胞定位的位置。利用pCXSN质粒重新构建植物过表达载体,瞬时侵染已感染PRSV番木瓜植株叶片,通过qPCR分析CpRBOHD和CpTIFY10A-like基因表达量的变化,同时测定瞬时表达叶片中的相关生理指标（SOD、PPO、CAT、PAL、MDA）变化情况。为今后通过基因进一步的调控番木瓜抗PRSV,增强其抗PRSV能力奠定了良好的基础。本研究所得结论如下:1、CpRBOHD基因（XM022044550.1）全长 3095bp,CDS（Coding sequence）区长度2760bp,编码919个氨基酸;蛋白相对分子质量103.74kDa,理论等电点pI=9.25,无信号肽,有4个跨膜域,蛋白结构预测α-螺旋所占的比例为43.63%,延伸链为14.47%,β-转角为4.57%,无规卷曲为37.32%。系统进化树显示CpRBOHD基因与榴莲、树棉和雷蒙德氏棉的相关基因可以聚为同一分支。qPCR分析发现在经过禾甲安处理后的感染PRSV的番木瓜叶片中CpRBOHD基因的表达量明显升高。由于本基因含有4个跨膜域,所以原核表达只截取757-919aa处氨基酸,构建了表达载体 pET28a-CpRBOHD-sumo,并且表达了 18.73kDa 蛋白。本基因构建 pNC-Green-CpRBOHD-SubN载体并在烟草细胞中发现亚细胞定位位置是在质膜上。2、CpTIFY10A-like基因（XM-022035541.1）全长 1352bp,CDS 区长 822 bp,编码273个氨基酸,蛋白的相对分子质量29.36kDa,理论等电点pI=9.23,无信号肽和跨膜域,编码蛋白属于TIFY-family的碱性蛋白,蛋白结构预测α-螺旋所占的比例为15.02%,延伸链为8.42%,β-转角为2.20%,无规卷曲为74.36%。系统进化树显示CpTIFY10A-like基因与酸枣,白梨相关的基因可以聚为同一分支。qPCR分析发现在经过禾甲安处理后感染PRSV的番木瓜叶片中CpTIFY10A-like基因表达量明显升高。构建了表达载体pET28a-CpTIFY10A-like-sumo,经过SDS-PAGE电泳检测表达蛋白29.36kDa,和理论预测结果相符合。本基因构建了 pNC-Green-CpTIFY10A-like-SubN载体并在烟草上的亚细胞定位位置是在细胞核上。3、番木瓜接种PRSV病毒16天后,叶片上出现PRSV明显病症,利用RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）技术从分子层面同步鉴定了 PRSV病毒。重新构建完成了植物过表达载体pCXSN-CpRBOHD载体与pCXSN-CpTIFY10A-like载体,分别在感染PRSV的番木瓜叶片上进行瞬时表达。通过qPCR技术测定发现CpRBOHD基因与CpTIFY10A-like基因的表达量都显著的上升,同时测定发现叶片中的抗病生理指标SOD、PPO、CAT、PAL酶活都相对的升高,MDA物质含量相对的减少,表明CpRBOHD基因上调表达和CpTIFY10A-like基因上调表达与番木瓜抗PRSV有一定关系。
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