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为了开发有机磷水解酶生物传感器,本文采用重复银镜反应制备银准参比电极及导电条,采用阳极氧化法制备银/氯化银准参比电极,探讨了碳糊工作电极制作工艺;研究了固定化材料、规格、辅助蛋白浓度对酶固定化效果的影响;优化了温度、pH等传感器检测参数,确定了酶生物传感器最佳检测条件,并检验了传感器的一致性、检测限及稳定性。主要研究内容包括三个部分,第一部分:薄层基础电极制备;第二部分:一次性固定化酶片制备;第三部分:酶生物传感器性能检测。取得以下研究成果:(1)银镜反应最佳基质为PVC绝缘胶布、反应试剂组成为2%硝酸银、5%氢氧化钠、2%氨水、10%葡萄糖;最佳反应温度为45℃;光照有利于银镜反应进行,但避免阳光直射;最佳反应时间为10min;基质是否事先于碱液中浸泡对银镜反应效果影响不显著。所有试剂应现配现用,银氨溶液在配制过程中切不可加入过量氨水。(2)银准参比电极最佳制备工艺为:银镜反应9次、面积98mm2;底物浓度、温度、pH值等因素对银准参比电极抗极化能力影响不显著。银∕氯化银准参比电极最佳制备工艺为:稀盐酸浓度0.1mol/L、阳极氧化时间3min;电极面积对抗极化能力影响不显著。二甲基硅油作为制备碳糊电极的黏结剂,其效果要好于液体石蜡;本文确定由M高纯石墨粉:M二甲基硅油7:3制备碳糊工作电极。通过循环扫描伏安法确定以银为准参比电极的薄层电极之间的差异小于10%。(3)酶固定化载体的孔径是影响固定化酶片效果的主要因素,最佳固定材料及试剂组成为:孔径0.8μm、厚度135μm的硝酸纤维素膜及10%牛血清白蛋白。(4)传感器的响应信号在起始时波动较大,最佳采集时间在45s;酶解时间为3min、温度为60℃、pH为8.0、酶量为280U;酶传感器检测的差异为7.5%;酶片在4℃条件下储存,24h后活性损失既大于50%,因此本实验制备的酶片只能一次性使用。在最优检测条件下,得到传感器的最低检测限为0.001 g/L,农药残留的标准曲线呈幂函数分布,幂函数方程为:y = 3.277x-1.4486,R2= 0.9828。以还原信号为检测对象的传感器,其信号要几倍于氧化信号,但易受背景信号影响,检测限比较高,并且不能呈现相关线性关系,数据间差异较大,需要进一步研究。