研究背景：骨肉瘤是最常见的骨的原发性恶性肿瘤,易感人群为青少年。它的预后极差,常发生早期转移。20%的病人死于肿瘤转移或无法切除的肿瘤,其余80%的病人在确诊时就已经有小的转移灶。许多病人在1年内会发生肺转移,5年生存率仅为15%。和许多其他恶性肿瘤一样,它的发病原因尚不明确。最近,大量新的诊断技术及有效的化疗方法不断发展,目前的5年生存率已经上升至55%-70%。术前辅助化疗,然后行根治性切除手术仍然是最有效的治疗方法。如果不可能手术切除,放疗可能对控制局部肿瘤有益。但是仍有许多病人有放化疗后肿瘤局部复发的风险。所以,很有必要探索一种新的替代治疗方案,尤其是基因治疗。生物节律是生物体内在的接近24小时的生物学循环。自然界中的有机体,从细菌到人类,均存在内在的分子钟节律。在哺乳动物中,核心的生物节律起搏器位于下丘脑的视交叉上核。这个时钟与环境中的昼夜节律是一致的。下丘脑中的中心生物钟与外周存在于机体每个细胞中的生物钟事实上是协调一致的。这种协调性可直接通过自主神经系统来实现,也可通过下丘脑、垂体及外周内分泌器官节律性的分泌激素来间接实现。生物节律的破坏对人体健康会产生显著影响。会导致睡眠障碍、胃肠、心血管的相关疾病以及抑郁。它还可导致一些癌症的发病率上升。在大鼠模型中,移植瘤在视交叉上核损伤的大鼠中生长率比在正常对照组快两倍。破坏昼夜节律就会导致生物节律破坏,像夜班工作者显著增加患癌几率,持续暴露于光坏境下的大鼠的肿瘤生长率会显著加快。反过来,癌症会影响患者的生物节律质量。生物节律被破坏的癌症患者死亡率较高,且受失眠和疲乏感困扰,生活质量更差。迄今,至少有9种调节昼夜节律的基因在哺乳动物体内被发现,它们是period 1 (Per1),period2 (Per2), period3 (Per3), CLOCK, cryptochromel(CRY1), cryptochrome2 (CRY2), BMAL1, casein kinasel epsilon (CSNK1E),和timeless (TIM)。Period2 (Per2)基因是一种核心的节律基因,它所表达的蛋白PER2在不同组织中有不同程度的表达,通过参与一系列的细胞通路调节机体的生物活动。它有抑制肿瘤的特点。在一些预后差、侵袭功能强的恶性肿瘤中,包括乳腺癌、肝癌、结直肠癌、胰腺癌,均发现Per2基因的调节异常。基因研究也已经表明,节律系统紊乱的老鼠有发展成多种肿瘤的倾向。mPer2缺失的老鼠肿瘤发生率显著增高。此外,功能学研究发现在体外实验以及异种移植小鼠体内试验中,Per2基因过表达可以抑制肿瘤细胞的生长。然而,目前Per2基因对骨肉瘤细胞的增殖和迁移的生物学作用却鲜有报告。为了明确Per2基因对骨肉瘤细胞的影响,我们分别用Per2小干扰片段(siRNA)及携带Per2真核表达载体(pcDNA3.1)的质粒转染骨肉瘤细胞,观察转染成功后骨肉瘤细胞的增殖、迁移及凋亡变化,并测试了与肿瘤细胞增殖、凋亡相关的几个基因及Akt细胞信号通路。研究目的：1.观察质粒及siRNA转染成功后,hPer2基因上调及下调后PER2蛋白的表达。2.观察骨肉瘤细胞hPer2基因上调及下调后,骨肉瘤细胞的增殖、迁移、凋亡功能的变化。3.探讨hPer2基因与Akt信号通路和bcl-2、p21、p27的关系,阐明hPer2基因发挥抑制骨肉瘤作用的具体机制,以期为骨肉瘤的生物钟治疗提供实验室基础和理论学依据。研究方法：1.构建携带Per2真核表达载体(pcDNA3.1)的质粒并转染至骨肉瘤细胞(MNNG/HOS C1#5 [R-1059-D]细胞系)中,上调PER2表达。用Per2小干扰片段(siRNA)转染至骨肉瘤细胞(MNNG/HOS C1#5 [R-1059-D]细胞系)中,下调PER2表达。免疫荧光实验证实转染成功并用Western blot在蛋白翻译水平上加以确认。2.细胞分组：基因干扰组：正常细胞组、正常细胞+LipofectamineTM 2000+小干扰的无效片段组、正常细胞+LipofectamineTM 2000+ hPer2 siRNA组基因过表达组：正常细胞组、正常细胞+LipofectamineTM 2000+ pcDNA3.1组、正常细胞+LipofectamineTM 2000+ hPer2质粒组3.细胞功能检测：细胞增殖实验：按上述分组,分别将骨肉瘤细胞种板,采用CCK-8试剂盒法检测转染对各组骨肉瘤细胞增殖功能的影响。细胞侵袭实验：将各组骨肉瘤细胞接种于Transwell小室上室(已铺好Matrigel基质胶),行无血清培养24小时,应用侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力。细胞凋亡实验：TUNEL法检测各组细胞的凋亡变化。4.肿瘤增殖、凋亡的相关细胞通路及基因检测,Western blot实验：收集各组骨肉瘤细胞,应用细胞裂解液(RIPA)提取细胞总蛋白,SDS-PAGE胶行凝胶电泳,应用Western blot方法检测转染后骨肉瘤细胞中Akt, bcl-2、p21、p27蛋白表达的变化。5.数据分析：实验数据以平均值±标准误表示。本研究数据均采用SPSS 16.0统计软件进行分析。单因素方差分析(one-way ANOVA)用于多组间比较,检验方差是否齐性,若方差齐,则用LSD检验；若数据方差不齐,则用Dunnett’s T3检验。P<0.05被认为具有统计学意义。研究结果1.siRNA成功下调per2蛋白表达,HOS增殖、侵袭能力增强,凋亡减少免疫荧光证实转染成功,并用Western Blot确认siRNA被成功转染并使相应的PER2蛋白下调。质粒转染48小时后,CCk8检测细胞增殖能力,结果显示siRNA组细胞增殖能力显著升高,与正常组和小干扰无效片段组相比具有统计学意义(p<0.01),干扰空载体组与正常组比较无统计学差异(p>0.05)。细胞转染24h后,收集细胞进行Transwell实验,24h后进行检测,结果显示与正常组和siRNA空载体组相比,per2 siRNA干扰后,穿过滤膜的HOS细胞数明显增多(p<0.01),细胞侵袭能力增强。干扰空载体组与正常组比较无统计学差异(p>0.05)。 Tunel染色显示细胞转染48h后,空载体组细胞凋亡较正常组增加(p<0.01),per2 siRNA干扰组较其空载体对照组凋亡显著降低(p<0.05)。2. hper2质粒成功上调per2蛋白表达,HOS增殖、侵袭能力减弱,凋亡增加免疫荧光证实转染成功,用Western Blot证实hPer2质粒被成功转染并使相应的PER2蛋白上调。质粒转染48小时后,CCk8检测细胞增殖能力,结果显示per2过表达组细胞增殖能力较正常组和空载体组显著降低(p<0.01),过表达空载体组与正常组比较均无统计学差异(p>0.05)。Transwell实验穿膜细胞数量可直观显示细胞侵袭能力。细胞转染24h后,收集细胞进行Transwell实验,24h后进行检测,结果显示与正常组和过表达空载体组相比,per2过表达组穿过滤膜的HOS细胞数明显减少(p<0.01),细胞侵袭能力减弱。过表达空载体组与正常组比较无统计学差异(p>0.05)。Tunel染色显示细胞转染48h后,质粒转染组及空载体组细胞凋亡较正常组均增加(p<0.05或p<0.01),per2过表达组较其空载体对照组凋亡显著增加(p<0.01)。3.Per2基因过表达抑制Akt信号通路转染48小时后,进行western blot实验,发现进行per2质粒过表达能够抑制骨肉瘤细胞的Akt信号通路,而研究表明,Akt信号通路在调节骨肉瘤等细胞的增殖和凋亡功能等方面具有重要作用,per2可能通过Akt信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。4.Per2基因过表达抑制Bcl-2的表达转染48小时后,进行western blot实验,发现进行per2质粒过表达能够抑制骨肉瘤细胞的Bcl-2蛋白表达,Bcl-2蛋白具有抗细胞凋亡的作用,由此我们推论,per2可能通过Bcl-2调控肿瘤细胞的凋亡5.Per2基因过表达促进p27的表达转染48小时后,进行western blot实验,发现进行per2质粒过表达能够促进骨肉瘤细胞的p27蛋白表达,p27具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,其表达上调能够抑制细胞增殖。6.Per2基因过表达促进p21的表达转染48小时后,进行western blot实验,发现进行per2质粒过表达能够促进骨肉瘤细胞的p21蛋白表达,p21具有抑制肿瘤细胞增殖的作用,其表达上调能够抑制细胞增殖。7.Per2基因表达下调后促进了Akt的磷酸化转染48小时后,进行western blot实验,发现干扰掉per2基因能够促进骨肉瘤细胞的增殖,减少骨肉瘤细胞的凋亡。而Akt信号通路的磷酸化上调,这说明per2基因表达下调有可能通过激活Akt的磷酸化促进骨肉瘤细胞的增殖。8.Per2基因表达下调后上调Bcl-2的表达转染48小时后,进行western blot实验,发现干扰掉per2基因,Bcl-2蛋白表达上调,说明per2基因下调可能通过上调Bcl-2降低骨肉瘤细胞的凋亡。9.Per2基因表达下调后下调了p21的表达转染48小时后,进行western blot实验,发现干扰掉per2基因,p21蛋白表达下调,说明per2基因下调可能通过下调p21增加骨肉瘤细胞的增殖。10.Per2基因表达下调对p27的表达影响不大结论1.构建的质粒及siRNA可成功转染骨肉瘤细胞(MNNG/HOS)。2. hPer2基因上调可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移并加速细胞凋亡。hPer2基因下调可促进骨肉瘤细胞的增殖、迁移并减缓细胞凋亡。3. hPer2基因过表达抑制Akt信号通路。Akt信号通路在调节骨肉瘤等细胞的增殖和凋亡功能等方面具有重要作用,per2可能通过Akt信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖和凋亡。4. hPer2可能通过Bcl-2调控骨肉瘤瘤细胞的凋亡。5. hPer2基因可能通过p27、p21基因调节骨肉瘤细胞的增殖。