实验目的：肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国以及世界其它地区的肿瘤性疾病中均为第一位。已有的研究表明，深入研究肺癌发生的分子机制，寻找到有效的分子生物学标志物对高危人群开展早期筛选，是降低肺癌的发生率和死亡率的有效途径之一。本课题组前期从DNA甲基化入手，以化合物诱导的大鼠肺癌为模型，对肺癌发生过程中的异常甲基化改变进行了全基因组筛选，发现ALX4（Aristaless-like Homeobox4）基因在肺癌发生过程中高甲基化，提示该基因甲基化与肺癌发生相关。进一步通过文献检索，发现该基因在结直肠癌和乳腺癌组织中呈现高甲基化，但是关于该基因甲基化是否调控其表达、以及在肿瘤发生中的功能和作用均没有报道。根据前期的实验结果和相关文献，我们推测ALX4基因可能是一个候选的抑癌基因，因此有必要深入研究该基因在肺癌发生发展过程中甲基化变化趋势与临床病理的关系，同时分析其在肺癌发生中的主要作用和功能，为后续全面研究该基因的生物学功能和抑癌作用机制提供资料。实验方法：1.采用甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）方法检测正常组织和肺癌组织、肺癌细胞株中ALX4基因甲基化的变化情况；2.利用RT-PCR对去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-dC）处理前后的肿瘤细胞中ALX4基因的表达进行分析，评价ALX4基因甲基化对其表达调控。3.构建了ALX4高表达和低表达细胞模型，利用细胞增殖实验（CCK-8法），细胞集落形成实验、流式细胞分析（Flow Cytometry）等实验和方法，对ALX4基因在肺癌发生过程中的功能进行了初步研究。实验结果：1.采用MSP方法检测了20例正常组织、98例肺癌组织、10例肺癌细胞株中的ALX4基因甲基化的发生情况。结果表明，正常组织中甲基化发生率为0%（0/20），98例肺癌组织中有52例发生了甲基化，甲基化发生率为53.1%；2.10例肺癌细胞株中有9例发生了甲基化，甲基化发生率为90%。3.对不同的分组和病理分型与ALX4基因甲基化的发生情况进行了比较。结果表明：以性别、年龄和吸烟与否进行分组，两组间ALX4基因甲基化发生率无明显差别；以病理分型进行分组，则随着分化程度从高到底（即肿瘤恶性程度的增高），ALX4基因甲基化发生率也随着明显增高。4.采用RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法检测了ALX4基因表达情况。发现其中9例ALX4基因甲基化的肺癌细胞株的基因表达水平与正常组织相比都出现表达缺失的情况，而未发生甲基化的一例肺癌细胞株（H1650），其基因表达水平明显高于正常对照组织和其它发生甲基化的肺癌细胞株。10例肺癌细胞株进行去甲基化药物处理后，ALX4基因mRNA的表达均明显升高，提示该基因启动子区域CpG岛高甲基化可能是导致其在肿瘤细胞株中表达缺失的重要原因。5.成功构建了ALX4基因高表达和低表达细胞模型。采用CCK-8法检测了细胞的生长情况。与对照组相比，在转染ALX4基因后肺癌细胞95D和H358的生长受到明显抑制明，转染组细胞集落形成数均少于对照组，说明ALX4基因高表达后细胞的增殖受到了抑制，提示ALX4基因具有抑制肿瘤细胞生长的功能。利用siRNA构建的低表达模型中，细胞生长明显增加。上述实验表明该基因具有明显的抑癌作用。6.通过对ALX4基因高表达细胞模型流式细胞仪检测，发现早期凋亡和晚期凋亡阶段的细胞明显增加，初步推断ALX4基因可以通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖，属于抑癌基因，有较好的研究价值。结论：1. ALX4基因在肺癌组织、肿瘤细胞中明显高甲基化，其甲基化发生率与肿瘤恶性程度呈负相关，是肺癌诊断的候选标志物。2. ALX4基因甲基化能调控基因的表达，且甲基化程度与表达呈负相关。3. ALX4基因可明显抑制肿瘤细胞生长，初步研究表明其抑制肿瘤细胞生长的机制是ALX4基因能诱导细胞凋亡，是一个潜在的抑癌基因。