目的:为发挥多西紫杉醇（docetaxel,DTX）与双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）协同抗肿瘤效果,本文设计了以肿瘤内环境还原响应的二硫键为连接臂的多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药（docetaxel-dihydroartemisinin prodrug）,通过纳米沉淀法制备成自组装纳米粒（docetaxel-dihydroartemisinin nanoconjugates,DSDNs）,并对纳米制剂的制剂学特性、在大鼠体内的药动学、对4T1细胞体外的抗肿瘤活性及对4T1荷瘤小鼠的体内抗肿瘤活性进行评价,以期为两者协同抗肿瘤提供支持。方法:1.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药的制备与表征以多西紫杉醇及双氢青蒿素为原料,通过两步酯化反应制备含有二硫键连接的DTX-DHA偶联前药（DTX-S-S-DHA）。采用高分辨质谱（HR-MS）,核磁共振氢谱与碳谱(¹H-NMR,¹³C-NMR)和傅里叶红外光谱仪（FT-IR）进行结构确证。2.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒的制备及处方优化采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）建立DTX-S-S-DHA的体外分析方法;采用纳米沉淀法制备DSDNs,并以粒径、包封率（entrapment efficiency,EE）、多分散指数（polydispersity,PDI）以及Zeta电位为评价指标对其进行处方优化;通过透射电镜（transmission electron microscope,TEM）观察DSDNs的表面形态,采用超滤离心法测定纳米粒的载药量（drug-loading,DL）,采用小杯法对还原响应释放行为进行了考察,并考察了DSDNs一个月的稳定性。3.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒在大鼠体内的药动学考察建立高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）测定大鼠血浆中DTX及DHA的含量。将12只雄性SD大鼠随机分为3组（n=4）,以多西紫杉醇溶液（DTX-sol）、双氢青蒿素溶液（DHA-sol）为对照,考察了DSDNs静脉注射至大鼠后的药动学,以AUC_0-t、AUC_0-∞、MRT、CL、t_1/2和V为指标评价其药动学特性。4.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体外抗肿瘤活性评价采用MTT法考察DSDNs对乳腺癌4T1细胞增殖的抑制作用;采用Annexin V-FITC/PI双染法进行细胞的凋亡研究;采用PI染色法进行周期抑制试验;采用划痕试验考察DTX-sol、DHA-sol、DTX和DHA混合溶液（MIX-sol）及DSDNs对4T1细胞的迁移抑制作用。5.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体内抗肿瘤活性评价建立4T1细胞皮下接种的Balb/c荷瘤小鼠模型,尾静脉注射对照组生理盐水（saline）、多西紫杉醇注射剂（DTX-inj）、DHA-sol、MIX-sol以及DSDNs溶液,通过连续5次隔天给药法,以小鼠体重变化、肿瘤生长体积、肿瘤重量、生存曲线以及H&E染色组织病理学结果为评价指标,评价DSDNs的体内抗肿瘤活性。结果:1.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药的合成与表征二硫代二丙酸脱水生成酸酐反应产率高达75.12%;二硫代二丙酸与双氢青蒿素产物（S-S-DHA）与DTX产率为55.39%。HR-MS测得的m/z为1288.479,产物经¹H-NMR,¹³C-NMR和FT-IR确证表明合成目标化合物正确。2.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒的制备及处方优化建立了HPLC法用于DTX-S-S-DHA含量测定及其制剂的体外制剂学评价,采用单因素及响应面法优化后的处方得到的纳米粒为淡蓝色乳状,粒径为172.10±1.70nm,PDI为0.05±0.01,Zeta电位为-22.60±0.50 mV,包封率为84.00%±1.30%,载药量为75.91%±1.20%,且在储存一个月之内稳定性良好,在条件为10 mM的二硫苏糖醇（DTT）条件下,DTX和DHA在48小时的累积释放量分别高达76.86%±3.10%及82.99%±3.98%。3.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒在大鼠体内的药动学考察尾静脉注射DTX-sol、DHA-sol及DSDNs至大鼠。给予DTX-sol、DSDNs后DTX的血药浓度时间曲线下面积(AUC_0-t)分别为35.26±6.67、64.97±9.00 mg/L?h,DTX的t_1/2分别为:6.08±1.29、9.41±3.16 h;给予DHA-sol、DSDNs后,DHA的血药浓度时间曲线下面积(AUC_0-t)分别为和0.54±0.21、0.30±0.16 mg/L?h,DHA的t_1/2分别为0.39±0.26、0.22±0.12 h。4.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体外抗肿瘤活性评价MTT试验表明对4T1细胞的增殖具有抑制作用,且具有时间依赖性与浓度依赖性,DTX-sol、DHA-sol、MIX-sol及DSDNs在48 h的IC₅₀分别为0.2201±0.0341,1.6060±0.1033,0.4419±0.0177,0.5113±0.0121μM,72 h时IC₅₀为0.0281±0.0199,0.3800±0.0213,0.1624±0.0118,0.1613±0.0036μM;细胞凋亡结果表明DSDNs具有更显著的诱导细胞凋亡能力（P<0.05）;细胞周期结果显示DSDNs主要阻滞4T1细胞在G₀/G₁期;划痕试验结果表明,与对照组相比,DSDNs具有更显著的抑制肿瘤细胞迁移的能力（P<0.01）。5.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体内抗肿瘤活性评价在体内抗肿瘤活性试验中,试验结束时,肿瘤体积大小顺序为:对照组>MIX-sol>DTX-inj>DHA-sol>DSDNs,对应肿瘤体积分别为:2482±102、1417±148、1241±118、1134±102、989±164 mm³;对照组、DTX-inj、DHA-sol、MIX-sol、DSDNs的平均瘤重为2.37±0.09、1.52±0.18,1.40±0.02,1.30±0.18,1.02±0.08g。在第20天时,DSDNs组小鼠存活率为8/8,DHA-sol组小鼠存活率为7/8、DTX-inj组小鼠存活率为5/8、MIX-sol组小鼠存活率为4/8、saline组小鼠存活率为3/8;H&E染色结果显示MIX-sol组出现肝损伤,其他制剂组,均未发现肝损伤。结论:1.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药的合成与表征HR-MS测得的精确质量数和理论值的相对误差在±3 ppm之内,¹H-NMR和¹³C-NMR的图谱结果与对应化合物的结构相一致,FI-TR结果表明对应化合物特征峰与化合物的结构特征相一致,表明成功合成了多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药。2.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒的制备及处方优化使用响应面法优化后的工艺条件制备的纳米粒形态、粒径及其分布、EE、DL、稳定性等评价指标都符合预期的要求。体外释放结果表明DSDNs具有还原响应性能。3.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒在大鼠体内的药动学考察将DTX与DHA通过二硫键连接后的偶联前药,可以优化药动学参数,增大DTX血药浓度,延长DTX半衰期等。4.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体外抗肿瘤活性评价DSDNs对4T1细胞的增殖具有抑制作用,具有较强的细胞毒性;可以显著诱导细胞凋亡;DSDNs与DHA-sol周期阻滞相似,表明通过化学键连接的DSDNs中DHA发挥主要作用;同时DSDNs组具有较强的抗迁移能力。5.多西紫杉醇-双氢青蒿素偶联前药自组装纳米粒体内抗肿瘤活性评价DSDNs具有较强的体内抗肿瘤活性,能显著抑制肿瘤体积的生长,显著提高了小鼠的存活率,且可以减小对正常组织的毒性。