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病毒载体在基因工程疫苗研究中发挥了重要作用。目前用于疫苗研究的病毒载体主要包括痘苗病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体以及逆转录病毒载体等。在这些病毒载体中,腺病毒载体是在疫苗的研究和开发中使用最多的载体之一。腺病毒载体根据能否产生活的子代病毒分为复制型和复制缺陷型（即非复制型）两种。复制型腺病毒载体进入机体细胞后,可以产生大量子代病毒,外源基因的数量会随着载体基因组的复制而增加,从而诱导机体产生强烈、持久的免疫反应。但同时腺病毒载体自身的蛋白也会大量表达,尤其是腺病毒的晚期蛋白（特别是五邻体蛋白）对机体有一定的毒性,因此复制型腺病毒载体的安全性有待提高。现在普遍使用的复制缺陷型腺病毒载体疫苗只能一次性感染细胞,不会产生子代病毒,安全性好,但外源基因表达相对较低,免疫效果比复制型腺病毒载体差。因此,研制一种既保留了载体基因组的复制能力又不产生子代病毒的新型腺病毒载体,将可能在保留载体高度安全的同时,大大提高外源基因的表达和免疫效果,促进其在疫苗研究中的广泛应用。为此,本研究在E1/E3双缺失的复制缺陷型腺病毒载体的基础上,通过顺式提供腺病毒部分或完整E1区以及缺失晚期调控基因Ⅳa2的办法,尝试构建一种保留基因组复制能力,但不会产生子代病毒的新型腺病毒载体,以及支持该病毒载体增殖的工程细胞系,从而组建一种新的复制缺陷型腺病毒载体系统。首先将表达部分或完整El区的表达盒插入到腺病毒骨架的不同位置,拯救获得多个在E1区表达外源基因的重组腺病毒。通过复制能力的比较,选择复制能力最强的结构作为构建新型复制缺陷型腺病毒载体系统的基础。其次,建立一种基于λ-RED重组酶系统的PCR打靶方法,利用该方法敲除腺病毒感染性克隆pFG140中的Ⅳa2基因,并用反式互补方式拯救获得Ⅳa2缺失的重组腺病毒。研究Ⅳa2基因的缺失对腺病毒晚期蛋白表达及病毒增殖的影响。经过以上探索,在AdMax系统中插入E1区、缺失Ⅳa2基因,组建通用的新型复制缺陷型腺病毒载体。最后,筛选稳定表达Ⅳa2基因的293细胞株,为该载体的应用提供保障。主要研究结果如下：1、确定了将腺病毒完整E1区插入到E1缺失区的结构作为构建新型复制缺陷型腺病毒载体系统的基础。将表达腺病毒部分El区（E1A）的表达盒PGK-E1A插入到腺病毒E3缺失区,获得重组腺病毒Ad5E1A+（IE3）。在HeLa细胞中证明,Ad5E1A+（IE3）不能产生子代病毒,但基因组48h能复制到约1.6E8copies/μg,此外几乎检测不到晚期蛋白的表达。即使在反式提供El区功能的293细胞中,Ad5E1A+（IE3）子代病毒的滴度在72h只能达到1.5E7FFU/mL水平,比阳性对照（Ad5E1-E3-293,约7.2E8FFU/mL）低了近50倍。将表达腺病毒完整E1区的表达盒PGK-E1插入到腺病毒E3缺失区,获得重组腺病毒Ad5E1+（IE3）。 Ad5E1+（IE3）在HeLa和A549细胞中都能产生子代病毒,基因组48h能复制到约4.5E8copies/μg,但子代病毒滴度72h也只能达到3.6E6FFU/mL。将PGK-E1插入到腺病毒El缺失区,获得重组病毒Ad5E1+（IE1）,该重组病毒在HeLa细胞中72h能产生约3.3E8FFU/mL的子代病毒,复制水平与阳性对照相当,因此选用该结构作为构建新型复制缺陷型腺病毒载体系统的基础。2、构建了基于Ⅳa2基因缺失的新型复制缺陷型腺病毒载体。首先建立了一种基于λ-RED重组酶系统的PCR打靶方法。以腺病毒感染性克隆pFG140为对象,通过λ-RED重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒PFG140-△Ⅳa2（1104）,酶切及DNA测序结果显示,pFG140上精确地缺失了预期的Ⅳa2基因3’端的1104bp片段。利用相同的方法,将包含4个拷贝的miRNA122靶序列插入到Ⅳa2基因3’非编码区,酶切及DNA测序证明目的序列精确地插入到了预期位置。以上两个例子在体外质粒上验证了,利用λ-RED重组酶介导的PCR打靶方法可以快速、精确的对质粒载体上腺病毒的基因组DNA序列进行改造。在pFG140-△Ⅳa2（1104）的基础上,获得了Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒Ad5△Ⅳa2（1104）,并证明Ⅳa2缺失的重组腺病毒在没有反式提供Ⅳa2基因的时候不能产生子代病毒,病毒基因组在感染后48h达到4.5E8copies/μg,但病毒晚期蛋白的表达受到抑制。综合Ad5E1+（IE1）和Ad5△Ⅳa2（1104）的结构,改造AdMax系统,获得了腺病毒完整E1区插入到E1缺失区同时Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒Ad5E1+（IE1）△Ⅳa2（1104）.该病毒的获得表明本研究成功的构建了一种新型复制缺陷型腺病毒载体。3、获得了稳定表达Ⅳa2蛋白的细胞株。将pAAV2neo-Ⅳa2（2）转染293细胞,G418加压筛选,获得了具有G418抗性的细胞株,命名为293-Ⅳa2。挑取数十株单克隆,有6株能支持Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒Ad5E1+（IE1）△Ⅳa2（1104）的复制,产生子代病毒。Western Blot表明,6株单克隆细胞都有Ⅳa2蛋白的表达,但表达水平有差异。选择Ⅳa2蛋白表达水平最高的4#克隆进行传代培养,15代的时候仍然能检测到Ⅳa2的表达,且表达水平未发现明显改变。这些稳定表达Ⅳa2蛋白的工程细胞系与拯救Ad5E1+（IE1）△Ⅳa2（1104）的重组质粒一起,建立了一种基于Ⅳa2基因缺失的新型复制缺陷型腺病毒载体系统。上述结果表明,本研究在El/E3双缺失的复制缺陷型腺病毒载体的基础上通过在E1缺失区插入腺病毒完整E1区的表达盒PGK-E1,获得了复制型腺病毒载体。通过基于λ-RED重组酶系统的PCR打靶方法,去除腺病毒晚期调控基因Ⅳa2,获得了基因组可复制但不能产生子代病毒的载体,同时建立了表达Ⅳa2的工程细胞系,可以互补重组病毒的繁殖。该病毒载体和细胞系共同组成了一种新的复制缺陷型腺病毒系统,为促进腺病毒载体在疫苗研究中的应用奠定了基础。