血管生成素(Angiogenin，ANG)是从人结肠癌细胞系HT-29的培养基中分离纯化的生长因子，因其具有强有力的促血管新生能力而得名．它是一个由123个氨基酸残基组成的碱性蛋白，分子量约为14 kDa，属核糖核酸酶超家族，具有促血管生成必不可少的微弱核糖核酸酶活性(约比核糖核酸酶A低5到6个数量级)。正常人体循环血液中存在一定浓度的血管生成素，约为300-400 ng／ml；而在一些血管生成相关疾病患者的血液中，血管生成素浓度明显增高，甚至超过500ng/ml．目前，我们不了解血液中为什么需要存在如此高浓度的血管生成素，也不十分了解它在这些血管生成相关疾病进程的作用。 血小板作为血管中流动的血液的基本组分之一，在某些刺激因素的作用下可以活化，发生聚集、粘附和／或释放反应，不仅在止血、凝血和维持血管壁完整性等正常生理功能中起关键作用，而且参与多种疾病的发生和发展．研究发现，血小板颗粒内含有bFGF、VEGF等血管生成调节因子，当血管损伤时，活化的血小板将这些调节因子释放到血液中，从而调节血管生成．有意思的是，在糖尿病、外周动脉闭塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)和肿瘤等患者的血液中，血管生成素的浓度与血小板的活性都有所增高．因此，我们认为探索了解血小板中是否存在血管生成素以及血小板与血管生成素问的关系是有重要意义的。 为此，在本论文的第一部分，我们首先运用免疫印迹(Western Blot)和细胞免疫荧光的方法研究了血管生成素在血小板内的存在情况。将血液中的血小板分离、洗涤、裂解后，进行SDS-PAGE，然后把蛋白质转移到膜上，利用抗血管生成素的抗体检测到血小板中确实存在ANG。同时，本论文还利用间接免疫荧光法研究ANG在血小板中的定位情况。激光共聚焦显微镜拍摄的图片表明，ANG广泛散布于血小板中，并且和假性血管血友病因子(von Willebrand Factor，vWF，一种存储于α颗粒中的分子)在位置上有一定程度的重叠，提示ANG可能存在于血小板的α颗粒中．本论文的第二部分主要探索血管生成素与血小板在功能上的关系。首先，为明确ANG对血小板释放功能的影响，我们应用流式细胞仪检测膜表面表达P选择素(P-selectin)的血小板百分率，以评价ANG(500 ng／ml和2500 ng／ml)能否诱导血小板脱颗粒。结果显示ANG对于静息状态(rest)的血小板没有明显的促颗粒内容物释放的作用。其次，为探索ANG与其它血小板活化因素对血小板聚集功能的影响，我们应用流式细胞仪检测膜表面结合纤维蛋白原(fibrinogen binding)的血小板百分率，以评价在ADP(10-6M)和凝血酶(Thrombin，0.04 U／ml)的激活作用下，ANG(2500 ng／ml)能否促进或抑制血小板聚集。结果表明，不论ANG与血小板孵育多少时间，不存在与ADP或Thrombin的协同或拮抗效应。另外，我们还利用血小板聚集仪测定富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)的透光性，来直观地研究在ADP(10-6 M)或胶原(collagen，lμg／ml)的作用下，ANG(2500 ng／ml)对血小板聚集的影响。结果显示不论ANG与血小板孵育多少时间，不存在与协同或拮抗效应。最后，为探讨ANG与collagen对血小板粘附功能的影响，我们应用血小板流动小室模拟小动脉或中动脉狭窄时的血流(剪切力为1500s-1)观察在collagen(0.2μg／cm2和1μg／cm2)包被的玻片上，ANG(2500ng／ml)能否促进或抑制血小板粘附。结果显示这两种浓度的COllagen和ANG没有协同或拮抗血小板粘附的作用。 以上两部分研究结果表明，虽然血小板中存在一定量的血管生成素，但在本论文的实验设计和条件下，没有观察到血管生成素对于血小板功能的影响。下一步的关键工作是探索明确血小板中存在的血管生成素的生理／病理意义。