背景与目的:　　诱导血管生成与抑制血管生成之间的相互作用关系是肿瘤发病机制中的一个关键因素。在肿瘤的增生、侵袭和转移中，新生血管的形成扮演着不可或缺的角色。在人类与啮齿类动物的肿瘤中，巨噬细胞是其重要的细胞组成部分。在绝大数肿瘤中，它们通常被称作为肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。在恶性肿瘤中，肿瘤相关巨噬细胞通常表现趋向于替代性活化的巨噬细胞类型，即M2型巨噬细胞。这种类型的巨噬细胞不仅可以增加肿瘤血管的生成，增强其迁移和侵袭能力，而且可以阻碍机体对肿瘤的免疫应答反应。在我们的前期研究中，我们发现广泛存在于各种植物当中的木犀草素在常氧条件下具有较强的抗肿瘤作用。肿瘤微环境有很多特征，其中基本特征之一是低氧环境，在该条件下，血管内皮生长因子的表达量显著上升。作为低氧条件下的关键转录因子HIF-1α的含量也相应的明显提高。HIF-1α可以通过P300/CBP增加VEGF转录的进行，也就是说HIF-1α影响VEGF的含量是通过在基因水平上的调控，继而对新生血管的产生起作用。我们通过用氯化钴构建一个低氧的环境，探索木犀草素在低氧条件下是否也发挥着类似的抗肿瘤作用。与此同时，探索木犀草素是否在低氧条件下存在特征性作用及信号通路变化。在下面的实验中，我们先探索出氯化钴及木犀草素的最合适浓度，然后再一起作用于巨噬细胞M2型，观察巨噬细胞M2型的血管生成相关因子，如VEGF、MMP9、TIMP1如何变化，并检测HIF-1α及STAT3相关通路的变化，以了解木犀草素是否可以降低TAM2型细胞血管生成的表达，探索其是否通过影响HIF-1α-VEGF和STAT3-VEGF信号通路来实现其抗肿瘤作用。　　方法：　　⑴通过CCK8实验分别检测0/5/10/20/30/40/60/80/160μM浓度的木犀草素和0/25/50/100/150/200/250/300/600μM浓度的CoCl2对巨噬细胞的生存状态的影响并确定最合适的木犀草素和CoCl2药物浓度。　　⑵通过WB和PCR实验从蛋白和基因水平研究了解不同浓度 CoCl2（0/25/50/100/200μM）对巨噬细胞的生物学作用，并进一步确认最佳的CoCl2作用浓度。　　⑶通过 Tanswell实验，研究了解木犀草素是否对巨噬细胞的迁移和侵袭产生影响，实验分为低氧空白组（100μM CoCl2）、低氧TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4）、低氧药物干预空白组（100μM CoCl2+20μM木犀草素）和低氧药物干预 TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4+20μM木犀草素）。　　⑷通过WB和PCR实验从蛋白和基因水平验证木犀草素对血管生成相关蛋白VEGF、MMP9和TIMP1的影响。实验也实验分为低氧空白组（100μM CoCl2）、低氧TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4）、低氧木犀草素干预空白组（100μM CoCl2+20μM木犀草素）和低氧木犀草素干预TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4+20μM木犀草素）。然后通过细胞免疫荧光实验检测木犀草素对细胞 VEGF表达的作用，实验分为低氧空白组（100μM CoCl2）、低氧TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4）、低氧药物干预空白组（100μM CoCl2+20μM木犀草素）和低氧药物干预TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4+20μM木犀草素）。　　⑸再用WB实验检测木犀草素对低氧关键转录因子HIF-1α、p-STAT3、STAT3的影响。实验分为低氧空白组（100μM CoCl2）、低氧TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4）、低氧药物干预空白组（100μM CoCl2+20μM木犀草素）和低氧药物干预TAM2组（100μM CoCl2+10 ng/ml IL4+20μM木犀草素）。　　结果：　　⑴用5/10/20μM浓度的木犀草素作用之后，巨噬细胞生存率并没有显著下调，而20μM以上的浓度处理之后，巨噬细胞生存率开始明显下降。CoCl2的CCK8实验结果也证实，用100μM浓度以下的CoCl2处理后，巨噬细胞生存率并没有显著降低，而150μM以上浓度的CoCl2处理后，巨噬细胞生存率开始明显下降（P＜0.05），这些浓度的CoCl2可以导致巨噬细胞的死亡大大增加。　　⑵在transwell实验中，我们发现TAM2型巨噬细胞侵袭能力比低氧空白组强，而迁移能力则比低氧空白组弱（P＜0.05），但加入木犀草素后，可以显著减少TAM2型细胞和低氧空白组细胞的侵袭和迁移数量（P＜0.05）。　　⑶WB结果显示，HIF-1α在正常组表达很少（P＜0.05）。然而，添加 CoCl2之后 HIF-1α含量显著升高（P＜0.05），与血管内皮生长因子含量增加相一致。当氯化钴浓度超过100μ M，与氯化钴的浓度在100μM相比时，HIF-1和VEGF的增加并不明显（P＞0.05）。这些结果表明，氯化钴（100μM）能稳定诱导缺氧的环境，为后续实验提供了依据。　　⑷WB和PCR检测发现，TAM2型巨噬细胞的VEGF和MMP-9的表达略高于低氧空白组（P＜0.05），这可能与低氧环境本身就能促进这些因子表达有关。然而，木犀草素处理下，VEGF和MMP9的表达明显减少（P＜0.05），而MMP9的生物抑制剂 TIMP1表达上升（P＜0.05）。此外，VEGF的免疫荧光实验也证实，木犀草素能减少细胞VEGF的含量，这与PCR及WB结果一致。　　⑸WB检测发现，TAM2组HIF-1α和p-STAT3的表达均高于低氧空白组（P＜0.05），但加入木犀草素后，两者的表达明显下降（P＜0.05），而 STAT3的表达则在各种之间无明显差距（P＞0.05）。　　统计方法：各组间比较采用单因素方差分析，以α=0.05为检验标准，P＜0.05为差异有统计学意义。　　结论：　　⑴CoCl2可以通过促进HIF-1α、VEGF表达而模拟低氧条件。　　⑵木犀草素能够降低 TAM2型巨噬细胞侵袭和迁移能力。即木犀草素在低氧环境下有对抗巨噬细胞侵袭和迁移的作用。　　⑶木犀草素可以作用于HIF-1α信号通路来减少细胞VEGF和MMP9的含量从而施展抗癌的功效。　　⑷木犀草素可以作用于STAT3信号通路来减少细胞VEGF和MMP9的含量从而施展抗癌的功效。