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赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)是一种世界范围内常见的由青霉菌属和曲霉菌属产生的真菌毒素，普遍存在于发霉的食物和饲料中。OTA于1965年被首次发现，后续研究证实其在很多物种中具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸性、神经毒性、免疫毒性、基因毒性及致肿瘤性，这些毒性作用具有物种及性别差异性。1993年OTA被国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)列为2B类的可能的人类致癌物。
我们团队前期研究显示OTA短期作用于人胃粘膜上皮(GES-1)细胞，可以引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高，造成氧化性DNA损伤，激活ATM-Chk2和ATM-p53信号通路，进而诱导GES-1细胞发生G2期阻滞；OTA长期作用可以通过氧化应激激活Wnt/β-catenin信号通路，介导GES-1细胞发生恶性转化。
线粒体是细胞内提供能量的重要细胞器，既是ROS的主要来源，又是ROS攻击的重要靶点。长期应激状态可以诱导细胞发生线粒体功能改变，这与肿瘤的发生发展密切相关。诸多研究提示线粒体损伤是OTA毒性作用的重要机制，但是OTA对GES-1细胞的毒性作用与线粒体的关系还不清楚，因此本研究探讨了短期OTA作用对GES-1细胞线粒体的影响。研究内容分为三个部分，第一部分观察了OTA作用后GES-1细胞内线粒体功能的改变，探讨了OTA对线粒体相关凋亡和自噬性细胞死亡的影响。第二部分观察了OTA对线粒体自噬的影响，并探讨了线粒体自噬发生的机制。第三部分观察了OTA对线粒体生物合成的影响，并探讨了抑制线粒体生物合成对OTA毒性作用的影响。
本研究从线粒体的角度为OTA对GES-1细胞的毒性作用机制提供了新的理论依据，也为OTA诱导GES-1细胞发生恶性转化的机制提供了新的线索。
第一部分OTA对GES-1细胞线粒体功能及程序性细胞死亡的影响
目的：从细胞内ROS生成、线粒体膜电位、细胞内ATP含量几个方面观察OTA对线粒体功能的影响，并观察OTA对凋亡和自噬的影响。
方法：1采用DCFH荧光探针及流式细胞术检测5,10,20μMOTA处理24h后GES-1细胞内ROS含量。2应用Westernblot检测OTA处理24h后GES-1细胞内抗氧化酶SOD-2及HO-1表达的变化。3应用JC-1荧光探针及流式细胞术检测OTA对GES-1细胞线粒体膜电位的影响。应用ATP试剂盒检测OTA处理对细胞内ATP含量的影响。4应用倒置相差显微镜及噻唑兰(MTT)比色法观察OTA作用对细胞数量及细胞活力的影响。5应用AnnexinⅤ和PI染液对GES-1细胞染色，通过流式细胞仪检测OTA处理对细胞凋亡率的影响；同时应用Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达情况；观察caspase抑制剂Z-VAD-FMK对细胞凋亡及细胞活力的影响。6应用细胞免疫荧光技术，通过激光共聚焦显微镜观察OTA对GES-1细胞内LC3B焦点的影响；同时采用GFP-LC质粒转染及荧光显微镜观察GFP-LC3的变化；应用Westernblot检测自噬相关蛋白的表达水平。7应用荧光显微镜观察自噬抑制剂CQ对细胞内GFP-LC3焦点形成的影响；应用Westernblot检测应用CQ后LC3B蛋白水平的变化及OTA处理后p62蛋白表达水平。8应用MTT检测自噬抑制剂CQ及3-MA对细胞活力的影响。9应用Westernblot检测自噬经典通路AMPK/mTOR分子的蛋白水平。
结果：
1.OTA对GES-1细胞内ROS水平及抗氧化酶蛋白水平的影响
流式细胞术结果显示5，10或20μMOTA处理24小时后GES-1细胞内的ROS水平显著增高(P＜0.05)。Westernblot结果表明抗氧化酶SOD-2及HO-1蛋白水平下降(P＜0.05)。
2.OTA对GES-1细胞线粒体膜电位(Δψm)及ATP含量的影响
流式细胞术结果显示应用5，10，或者20μMOTA处理8h后，细胞内JC-1单体增多(P＜0.05)，提示Δψm下降。ATP试剂盒及化学发光仪检测结果提示给予5，10，或者20μMOTA处理后，GES-1细胞内ATP含量下降(P＜0.05)。
3.OTA处理对GES-1细胞形态、数量及细胞活力的影响
倒置相差显微镜下观察，未给予OTA处理的GES-1细胞形态为梭形，排列规则；5,10,或者20μMOTA处理后，GES-1细胞形态由梭形变为不规则形，部分细胞拉长，细胞排列紊乱，细胞间毛刺及连接增多。细胞计数结果表明给予OTA处理后，细胞数目减少(P＜0.05)。MTT检测显示5,10,或者20μMOTA处理不同时间后，细胞活力较对照组均发生明显下降(P＜0.05)。
4.OTA对GES-1细胞凋亡的影响
流式细胞术结果显示10μM或者20μMOTA处理24小时后GES-1细胞凋亡增多(P＜0.05)。Westernblot结果显示全长的caspase-3及PARP表达下调，剪切的caspase-3及PARP上调(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-xL表达下降，凋亡蛋白全长caspase-9表达下调,剪切caspase-9表达上调，提示OTA诱导GES-1细胞发生了线粒体途径相关凋亡。Z-VAD-FMK可以减轻OTA诱导的细胞凋亡，使细胞活力增加(P＜0.05)，提示OTA诱导的凋亡确实是caspase依赖的。
5.OTA对GES-1细胞自噬的影响
细胞免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察显示，与对照组相比，10μMOTA处理组LC3B焦点明显增多(P＜0.05)，转染GFP-LC3质粒的细胞内GFP-LC3焦点明显增多(P＜0.05)，提示OTA诱导GES-1细胞内自噬小体增多。Westernblot检测结果显示5，10或者20μMOTA处理24小时后，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例增高，Atg3，Atg5表达增多，Beclin-1表达降低(P＜0.05)。不同浓度OTA处理8h后Beclin-1表达增多。综上结果提示OTA可能诱导GES-1细胞发生了自噬。
6.OTA对GES-1细胞自噬流的影响
转染GFP-LC3质粒后通过荧光显微镜观察细胞内GFP-LC3焦点，结果显示CQ及OTA同时处理组与CQ或者OTA单独处理组相比，细胞内GFP-LC3焦点明显增多(P＜0.05)；Westernblot结果提示同时应用CQ及OTA处理，LCB-Ⅱ增多更明显(P＜0.05)；5，10或者20μMOTA处理24h，p62蛋白表达明显下降(P＜0.05)。这些结果证明OTA处理后GES-1细胞内的自噬流是被激活的。
7.自噬抑制剂对OTA作用的影响
MTT结果显示使用CQ或者3-MA后，OTA对细胞存活的抑制作用得到了一定程度的缓解(P＜0.05)，提示在本研究中，自噬对细胞存活是不利的。
8.OTA处理对AMPK/mTOR通路的影响
Westernblot检测显示5,10,或者20μMOTA处理24h后，AMPK-α及p-AMPK-α表达明显增多，而p-mTOR表达明显下降(P＜0.05)，说明OTA激活了AMPK/mTOR通路。
小结：
1.OTA短期作用于GES-1细胞，造成细胞内ROS升高，抗氧化酶表达下降，线粒体膜电位下降，ATP生成减少。
2.OTA诱导GES-1细胞发生线粒体相关凋亡及自噬性细胞死亡，抑制自噬可以一定程度抑制OTA诱导的细胞活力下降。
3.OTA激活了自噬的经典通路AMPK/mTOR。
第二部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体自噬的影响及机制
目的：观察OTA是否诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬，并探讨Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中的作用。
方法：1通过透射电镜观察OTA作用后GES-1细胞内的自噬小体。2对GES-1细胞进行GFP-LC3质粒转染，同时对细胞进行MitoTracker染色，应用激光共聚焦显微镜观察细胞内GFP-LC3焦点与MitoTracker的共定位。3对细胞进行MitoTracker与LysoTracker染色，应用激光共聚焦显微镜观察二者的共定位4应用RT-PCR检测Parkin在mRNA水平的表达，并应用细胞免疫荧光检测Parkin的线粒体定位。5应用ParkinsiRNA对GES-1细胞进行转染，并通过RT-PCR和Westernblot验证敲低效率。6对GES-1细胞转染ParkinsiRNA及ControlsiRNA后观察细胞内包含线粒体的自噬小体，LC3B的表达变化及细胞活力的改变。7对GES-1细胞进行MitoTracker染色，激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态，并依据线粒体形态对细胞进行分类统计。应用RT-PCR及Westernblot检测线粒体融合/分裂平衡调节分子的mRNA和蛋白水平。
结果：
1.OTA对线粒体自噬的影响
电镜结果显示，10μMOTA处理24h后，GES-1细胞内包含线粒体的自噬小体增多(P＜0.05)，提示OTA诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬。对细胞进行GFP-LC3质粒转染及MitoTracker染色后于激光共聚焦显微镜下观察，结果表明，10μMOTA处理24h后，GES-1细胞内MitoTracker及GFP-LC3的共定位明显增多(P＜0.05)，提示OTA处理后GES-1细胞内包含线粒体的自噬小体增多。进一步应用MitoTracker标记线粒体，LysoTracker标记溶酶体，共聚焦显微镜下观察二者的共定位。结果提示5,10及20μMOTA处理24h后，GES-1细胞内MitoTracker及LysoTracker的共定位明显增多(P＜0.05)，提示OTA处理后GES-1细胞内包含线粒体的自噬溶酶体增多。综上结果表明，OTA处理后，GES-1细胞线粒体自噬增多。
2.Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中的作用
RT-PCR结果显示5,10或者20μMOTA处理24h后，Parkin的mRNA水平明显升高(P＜0.05)；细胞免疫荧光及MitoTracker染色后，激光共聚焦显微镜下观察结果显示Pakin与线粒体共定位明显增多。说明Parkin可能参与了OTA诱导的线粒体自噬。ParkinsiRNA和ControlsiRNA转染GES-1细胞48h后收集细胞进行PCR和Westernblot，结果表明ParkinsiRNA可以明显降低Parkin在mRNA水平和蛋白水平的表达(P＜0.05)。LC3B细胞免疫荧光及MitoTracker染色结果表明，与siRNA组相比，ParkinsiRNA组的GES-1细胞给予10μMOTA处理24h后，Parkin与MitoTracker的共定位显著减少(P＜0.05)。同时Westernblot检测结果显示，敲低Parkin之后OTA处理组LC3BⅡ/Ⅰ降低(P＜0.05)。MTT结果表明，与ControlsiRNA组相比，ParkinsiRNA组给予OTA处理后细胞活力有所改善(P＜0.05)综上结果表明，Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中发挥重要作用，敲低Parkin表达可以抑制OTA诱导的线粒体自噬，改善细胞活力。
3.OTA对线粒体融合/分裂的影响
激光共聚焦观察显示对照组线粒体分布在细胞核周围，线粒体形态比较均一；5,10或者20μMOTA处理24h后，GES-1细胞以长管状或细丝状线粒体为主的细胞增多，以短棒状线粒体为主的细胞减少(P＜0.05)。RT-PCR结果显示Drp1,Mfn1,Mfn2的mRNA水平在10或者20μMOTA处理24h后有不同程度的下降；Fis1的mRNA水平在5,10或者20μMOTA处理24h后均有不同程度下降；而OPA1的mRNA水平在5或者10μMOTA处理组明显增多，20μM组下降(P＜0.05)。Westernblot结果显示Drp1及Mfn2的蛋白水平在5,10或者20μMOTA处理24h时下降，OPA1的蛋白水平在5或10μMOTA处理24h时表达增多，20μM时表达下降(P＜0.05)。20μMOTA处理GES-1细胞4h,8h,12h或者24h后，Drp1,Mfn2及OPA1均有不同程度的下降(P＜0.05)。综上结果表明，OTA影响了GES-1细胞的线粒体形态，影响了融合/分裂平衡相关蛋白的表达。
小结：
1.OTA短期处理诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬。
2.OTA诱导的线粒体自噬是Parkin依赖的，通过siRNA敲低Parkin表达可以抑制线粒体自噬，提高细胞活力。
3.OTA影响了GES-1细胞融合/分裂平衡相关蛋白的表达，改变了线粒体形态。
第三部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体生物合成的影响
目的：观察赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体生物合成的影响，探讨抑制线粒体生物合成对OTA作用的影响。
方法：
1.对细胞进行MitoTracker染色后应用流式细胞仪检测线粒体质量；应用RT-PCR检测线粒体DNA拷贝数。
2.应用Westernblot检测线粒体标志蛋白HSP60及Tim23的表达水平。
3.应用RT-PCR及Westernblot检测生物合成通路分子的mRNA和蛋白水平。
4应用RT-PCR及Westernblot验证siRNA的敲低效率。5应用线粒膜电位检测试剂盒及荧光发光仪检测线粒体膜电位；应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量6应用MTT检测细胞活力。
结果：
1.OTA对线粒体质量和mtDNA拷贝数的影响
MitoTrackergreen染色及流式细胞术检测结果表明与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，GES-1细胞内的MitoTracker荧光强度没有明显变化。Westernblot检测结果显示，5,10,或者20μMOTA处理24h后HSP60和Tim23的蛋白水平都没有明显变化。流式细胞术及Westernblot的结果均提示OTA处理没有影响GES-1细胞的线粒体质量。RT-PCR结果提示，不同浓度OTA处理24h后，细胞内的mtDNA拷贝数没有明显变化。
2.OTA对GES-1细胞线粒体生物合成通路分子表达的影响
RT-PCR结果提示，与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，线粒体生物合成通路分子(包括AMPKα1,PGC1α,NRF1,TFAM)的mRNA水平均有不同程度的增强(P＜0.05)。Westernblot检测结果显示，与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，线粒体生物合成通路分子的蛋白表达水平均有明显的增强(P＜0.05)。说明调控线粒体生物合成的AMPK/PGC1α通路被激活。
3.干扰TFAM表达对OTA作用的影响
对GES-1细胞进行ControlsiRNA及TFAMsiRNA转染，RT-PCR及Westernblot结果显示：TFAMsiRNA可以显著降低TFAM在mRNA水平和蛋白水平的表达(P＜0.05)。RT-PCR结果显示TFAMsiRNA+OTA处理组的mtDNA拷贝数较ControlsiRNA+OTA处理组明显降低(P＜0.05)，流式细胞仪检测结果显示TFAMsiRNA+OTA处理组的MitoTrackergreen荧光强度较ControlsiRNA+溶剂对照组相比明显下降(P＜0.05)，提示在敲低TFAM表达的GES-1细胞，OTA引起了线粒体质量下降。线粒体膜电位检测结果显示，TFAMsiRNA+OTA处理组的线粒体膜电位明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。ATP检测试剂盒结果显示，TFAMsiRNA+OTA处理组的细胞内ATP含量明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。MTT结果表明，给予5,10或者20μM处理48h后，TFAMsiRNA+OTA处理组的细胞活力明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。综上结果表明：敲低TFAM表达后，线粒体质量和mtDNA拷贝数发生了下降，而且线粒体功能损伤更明显，细胞活力下降更显著。
4干扰NRF1表达对OTA作用的影响
对GES-1细胞进行ControlsiRNA及NRF1siRNA转染，RT-PCR结果及Westernblot结果显示，NRF1siRNA可以显著降低NRF1在mRNA和蛋白水平的表达(P＜0.05)。Westernblot检测结果显示，NRF1siRNA+OTA处理组的TFAM表达明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)，说明OTA诱导的TFAM表达上调由NRF1介导。对细胞进行MitoTracker染色，并应用流式细胞仪检测荧光强度，结果显示：NRF1siRNA+OTA组的MitoTrackergreen荧光强度明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.0.5)。说明敲低NRF1表达线粒体质量明显下降。
小结：
1.短期OTA处理激活了AMPK/PGC-1α/NRF-1/TFAM通路，促进了线粒体生物合成。
2.通过siRNA干扰TFAM的表达可以导致线粒体质量及mtDNA拷倍数下降，细胞内ATP及ΔΨM下降更明显，同时细胞活力下降更多，说明促进线粒体生物合成对GES-1细胞起了一定的保护作用。
结论：
1.OTA导致GES-1细胞内ROS升高，造成线粒体功能障碍，导致线粒体膜电位下降及ATP含量减少。
2.OTA导致GES-1细胞发生了线粒体途径相关凋亡及自噬性细胞死亡。Caspase抑制剂或者自噬抑制剂可以一定程度上抑制OTA造成的细胞活力下降。
3.OTA导致GES-1细胞发生了依赖Parkin的线粒体自噬，通过ParkinsiRNA抑制线粒体自噬可以改善细胞活力。
4.OTA在GES-1细胞中引起线粒体自噬的同时，激活了AMPK/PGC-1α/NRF-1/TFAM通路，促进了线粒体生物合成。
5.使用siRNA敲低TFAM表达，可以导致线粒体质量下降，线粒体功能障碍更严重，细胞活力下降更明显，线粒体生物合成对GES-1细胞起了一定的保护作用。
我们团队前期研究显示OTA短期作用于人胃粘膜上皮(GES-1)细胞，可以引起活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高，造成氧化性DNA损伤，激活ATM-Chk2和ATM-p53信号通路，进而诱导GES-1细胞发生G2期阻滞；OTA长期作用可以通过氧化应激激活Wnt/β-catenin信号通路，介导GES-1细胞发生恶性转化。
线粒体是细胞内提供能量的重要细胞器，既是ROS的主要来源，又是ROS攻击的重要靶点。长期应激状态可以诱导细胞发生线粒体功能改变，这与肿瘤的发生发展密切相关。诸多研究提示线粒体损伤是OTA毒性作用的重要机制，但是OTA对GES-1细胞的毒性作用与线粒体的关系还不清楚，因此本研究探讨了短期OTA作用对GES-1细胞线粒体的影响。研究内容分为三个部分，第一部分观察了OTA作用后GES-1细胞内线粒体功能的改变，探讨了OTA对线粒体相关凋亡和自噬性细胞死亡的影响。第二部分观察了OTA对线粒体自噬的影响，并探讨了线粒体自噬发生的机制。第三部分观察了OTA对线粒体生物合成的影响，并探讨了抑制线粒体生物合成对OTA毒性作用的影响。
本研究从线粒体的角度为OTA对GES-1细胞的毒性作用机制提供了新的理论依据，也为OTA诱导GES-1细胞发生恶性转化的机制提供了新的线索。
第一部分OTA对GES-1细胞线粒体功能及程序性细胞死亡的影响
目的：从细胞内ROS生成、线粒体膜电位、细胞内ATP含量几个方面观察OTA对线粒体功能的影响，并观察OTA对凋亡和自噬的影响。
方法：1采用DCFH荧光探针及流式细胞术检测5,10,20μMOTA处理24h后GES-1细胞内ROS含量。2应用Westernblot检测OTA处理24h后GES-1细胞内抗氧化酶SOD-2及HO-1表达的变化。3应用JC-1荧光探针及流式细胞术检测OTA对GES-1细胞线粒体膜电位的影响。应用ATP试剂盒检测OTA处理对细胞内ATP含量的影响。4应用倒置相差显微镜及噻唑兰(MTT)比色法观察OTA作用对细胞数量及细胞活力的影响。5应用AnnexinⅤ和PI染液对GES-1细胞染色，通过流式细胞仪检测OTA处理对细胞凋亡率的影响；同时应用Westernblot检测凋亡相关蛋白的表达情况；观察caspase抑制剂Z-VAD-FMK对细胞凋亡及细胞活力的影响。6应用细胞免疫荧光技术，通过激光共聚焦显微镜观察OTA对GES-1细胞内LC3B焦点的影响；同时采用GFP-LC质粒转染及荧光显微镜观察GFP-LC3的变化；应用Westernblot检测自噬相关蛋白的表达水平。7应用荧光显微镜观察自噬抑制剂CQ对细胞内GFP-LC3焦点形成的影响；应用Westernblot检测应用CQ后LC3B蛋白水平的变化及OTA处理后p62蛋白表达水平。8应用MTT检测自噬抑制剂CQ及3-MA对细胞活力的影响。9应用Westernblot检测自噬经典通路AMPK/mTOR分子的蛋白水平。
结果：
1.OTA对GES-1细胞内ROS水平及抗氧化酶蛋白水平的影响
流式细胞术结果显示5，10或20μMOTA处理24小时后GES-1细胞内的ROS水平显著增高(P＜0.05)。Westernblot结果表明抗氧化酶SOD-2及HO-1蛋白水平下降(P＜0.05)。
2.OTA对GES-1细胞线粒体膜电位(Δψm)及ATP含量的影响
流式细胞术结果显示应用5，10，或者20μMOTA处理8h后，细胞内JC-1单体增多(P＜0.05)，提示Δψm下降。ATP试剂盒及化学发光仪检测结果提示给予5，10，或者20μMOTA处理后，GES-1细胞内ATP含量下降(P＜0.05)。
3.OTA处理对GES-1细胞形态、数量及细胞活力的影响
倒置相差显微镜下观察，未给予OTA处理的GES-1细胞形态为梭形，排列规则；5,10,或者20μMOTA处理后，GES-1细胞形态由梭形变为不规则形，部分细胞拉长，细胞排列紊乱，细胞间毛刺及连接增多。细胞计数结果表明给予OTA处理后，细胞数目减少(P＜0.05)。MTT检测显示5,10,或者20μMOTA处理不同时间后，细胞活力较对照组均发生明显下降(P＜0.05)。
4.OTA对GES-1细胞凋亡的影响
流式细胞术结果显示10μM或者20μMOTA处理24小时后GES-1细胞凋亡增多(P＜0.05)。Westernblot结果显示全长的caspase-3及PARP表达下调，剪切的caspase-3及PARP上调(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-xL表达下降，凋亡蛋白全长caspase-9表达下调,剪切caspase-9表达上调，提示OTA诱导GES-1细胞发生了线粒体途径相关凋亡。Z-VAD-FMK可以减轻OTA诱导的细胞凋亡，使细胞活力增加(P＜0.05)，提示OTA诱导的凋亡确实是caspase依赖的。
5.OTA对GES-1细胞自噬的影响
细胞免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察显示，与对照组相比，10μMOTA处理组LC3B焦点明显增多(P＜0.05)，转染GFP-LC3质粒的细胞内GFP-LC3焦点明显增多(P＜0.05)，提示OTA诱导GES-1细胞内自噬小体增多。Westernblot检测结果显示5，10或者20μMOTA处理24小时后，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比例增高，Atg3，Atg5表达增多，Beclin-1表达降低(P＜0.05)。不同浓度OTA处理8h后Beclin-1表达增多。综上结果提示OTA可能诱导GES-1细胞发生了自噬。
6.OTA对GES-1细胞自噬流的影响
转染GFP-LC3质粒后通过荧光显微镜观察细胞内GFP-LC3焦点，结果显示CQ及OTA同时处理组与CQ或者OTA单独处理组相比，细胞内GFP-LC3焦点明显增多(P＜0.05)；Westernblot结果提示同时应用CQ及OTA处理，LCB-Ⅱ增多更明显(P＜0.05)；5，10或者20μMOTA处理24h，p62蛋白表达明显下降(P＜0.05)。这些结果证明OTA处理后GES-1细胞内的自噬流是被激活的。
7.自噬抑制剂对OTA作用的影响
MTT结果显示使用CQ或者3-MA后，OTA对细胞存活的抑制作用得到了一定程度的缓解(P＜0.05)，提示在本研究中，自噬对细胞存活是不利的。
8.OTA处理对AMPK/mTOR通路的影响
Westernblot检测显示5,10,或者20μMOTA处理24h后，AMPK-α及p-AMPK-α表达明显增多，而p-mTOR表达明显下降(P＜0.05)，说明OTA激活了AMPK/mTOR通路。
小结：
1.OTA短期作用于GES-1细胞，造成细胞内ROS升高，抗氧化酶表达下降，线粒体膜电位下降，ATP生成减少。
2.OTA诱导GES-1细胞发生线粒体相关凋亡及自噬性细胞死亡，抑制自噬可以一定程度抑制OTA诱导的细胞活力下降。
3.OTA激活了自噬的经典通路AMPK/mTOR。
第二部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体自噬的影响及机制
目的：观察OTA是否诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬，并探讨Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中的作用。
方法：1通过透射电镜观察OTA作用后GES-1细胞内的自噬小体。2对GES-1细胞进行GFP-LC3质粒转染，同时对细胞进行MitoTracker染色，应用激光共聚焦显微镜观察细胞内GFP-LC3焦点与MitoTracker的共定位。3对细胞进行MitoTracker与LysoTracker染色，应用激光共聚焦显微镜观察二者的共定位4应用RT-PCR检测Parkin在mRNA水平的表达，并应用细胞免疫荧光检测Parkin的线粒体定位。5应用ParkinsiRNA对GES-1细胞进行转染，并通过RT-PCR和Westernblot验证敲低效率。6对GES-1细胞转染ParkinsiRNA及ControlsiRNA后观察细胞内包含线粒体的自噬小体，LC3B的表达变化及细胞活力的改变。7对GES-1细胞进行MitoTracker染色，激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态，并依据线粒体形态对细胞进行分类统计。应用RT-PCR及Westernblot检测线粒体融合/分裂平衡调节分子的mRNA和蛋白水平。
结果：
1.OTA对线粒体自噬的影响
电镜结果显示，10μMOTA处理24h后，GES-1细胞内包含线粒体的自噬小体增多(P＜0.05)，提示OTA诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬。对细胞进行GFP-LC3质粒转染及MitoTracker染色后于激光共聚焦显微镜下观察，结果表明，10μMOTA处理24h后，GES-1细胞内MitoTracker及GFP-LC3的共定位明显增多(P＜0.05)，提示OTA处理后GES-1细胞内包含线粒体的自噬小体增多。进一步应用MitoTracker标记线粒体，LysoTracker标记溶酶体，共聚焦显微镜下观察二者的共定位。结果提示5,10及20μMOTA处理24h后，GES-1细胞内MitoTracker及LysoTracker的共定位明显增多(P＜0.05)，提示OTA处理后GES-1细胞内包含线粒体的自噬溶酶体增多。综上结果表明，OTA处理后，GES-1细胞线粒体自噬增多。
2.Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中的作用
RT-PCR结果显示5,10或者20μMOTA处理24h后，Parkin的mRNA水平明显升高(P＜0.05)；细胞免疫荧光及MitoTracker染色后，激光共聚焦显微镜下观察结果显示Pakin与线粒体共定位明显增多。说明Parkin可能参与了OTA诱导的线粒体自噬。ParkinsiRNA和ControlsiRNA转染GES-1细胞48h后收集细胞进行PCR和Westernblot，结果表明ParkinsiRNA可以明显降低Parkin在mRNA水平和蛋白水平的表达(P＜0.05)。LC3B细胞免疫荧光及MitoTracker染色结果表明，与siRNA组相比，ParkinsiRNA组的GES-1细胞给予10μMOTA处理24h后，Parkin与MitoTracker的共定位显著减少(P＜0.05)。同时Westernblot检测结果显示，敲低Parkin之后OTA处理组LC3BⅡ/Ⅰ降低(P＜0.05)。MTT结果表明，与ControlsiRNA组相比，ParkinsiRNA组给予OTA处理后细胞活力有所改善(P＜0.05)综上结果表明，Parkin在OTA诱导的线粒体自噬中发挥重要作用，敲低Parkin表达可以抑制OTA诱导的线粒体自噬，改善细胞活力。
3.OTA对线粒体融合/分裂的影响
激光共聚焦观察显示对照组线粒体分布在细胞核周围，线粒体形态比较均一；5,10或者20μMOTA处理24h后，GES-1细胞以长管状或细丝状线粒体为主的细胞增多，以短棒状线粒体为主的细胞减少(P＜0.05)。RT-PCR结果显示Drp1,Mfn1,Mfn2的mRNA水平在10或者20μMOTA处理24h后有不同程度的下降；Fis1的mRNA水平在5,10或者20μMOTA处理24h后均有不同程度下降；而OPA1的mRNA水平在5或者10μMOTA处理组明显增多，20μM组下降(P＜0.05)。Westernblot结果显示Drp1及Mfn2的蛋白水平在5,10或者20μMOTA处理24h时下降，OPA1的蛋白水平在5或10μMOTA处理24h时表达增多，20μM时表达下降(P＜0.05)。20μMOTA处理GES-1细胞4h,8h,12h或者24h后，Drp1,Mfn2及OPA1均有不同程度的下降(P＜0.05)。综上结果表明，OTA影响了GES-1细胞的线粒体形态，影响了融合/分裂平衡相关蛋白的表达。
小结：
1.OTA短期处理诱导GES-1细胞发生了线粒体自噬。
2.OTA诱导的线粒体自噬是Parkin依赖的，通过siRNA敲低Parkin表达可以抑制线粒体自噬，提高细胞活力。
3.OTA影响了GES-1细胞融合/分裂平衡相关蛋白的表达，改变了线粒体形态。
第三部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体生物合成的影响
目的：观察赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体生物合成的影响，探讨抑制线粒体生物合成对OTA作用的影响。
方法：
1.对细胞进行MitoTracker染色后应用流式细胞仪检测线粒体质量；应用RT-PCR检测线粒体DNA拷贝数。
2.应用Westernblot检测线粒体标志蛋白HSP60及Tim23的表达水平。
3.应用RT-PCR及Westernblot检测生物合成通路分子的mRNA和蛋白水平。
4应用RT-PCR及Westernblot验证siRNA的敲低效率。5应用线粒膜电位检测试剂盒及荧光发光仪检测线粒体膜电位；应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量6应用MTT检测细胞活力。
结果：
1.OTA对线粒体质量和mtDNA拷贝数的影响
MitoTrackergreen染色及流式细胞术检测结果表明与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，GES-1细胞内的MitoTracker荧光强度没有明显变化。Westernblot检测结果显示，5,10,或者20μMOTA处理24h后HSP60和Tim23的蛋白水平都没有明显变化。流式细胞术及Westernblot的结果均提示OTA处理没有影响GES-1细胞的线粒体质量。RT-PCR结果提示，不同浓度OTA处理24h后，细胞内的mtDNA拷贝数没有明显变化。
2.OTA对GES-1细胞线粒体生物合成通路分子表达的影响
RT-PCR结果提示，与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，线粒体生物合成通路分子(包括AMPKα1,PGC1α,NRF1,TFAM)的mRNA水平均有不同程度的增强(P＜0.05)。Westernblot检测结果显示，与对照组相比，5,10,或者20μMOTA处理24h后，线粒体生物合成通路分子的蛋白表达水平均有明显的增强(P＜0.05)。说明调控线粒体生物合成的AMPK/PGC1α通路被激活。
3.干扰TFAM表达对OTA作用的影响
对GES-1细胞进行ControlsiRNA及TFAMsiRNA转染，RT-PCR及Westernblot结果显示：TFAMsiRNA可以显著降低TFAM在mRNA水平和蛋白水平的表达(P＜0.05)。RT-PCR结果显示TFAMsiRNA+OTA处理组的mtDNA拷贝数较ControlsiRNA+OTA处理组明显降低(P＜0.05)，流式细胞仪检测结果显示TFAMsiRNA+OTA处理组的MitoTrackergreen荧光强度较ControlsiRNA+溶剂对照组相比明显下降(P＜0.05)，提示在敲低TFAM表达的GES-1细胞，OTA引起了线粒体质量下降。线粒体膜电位检测结果显示，TFAMsiRNA+OTA处理组的线粒体膜电位明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。ATP检测试剂盒结果显示，TFAMsiRNA+OTA处理组的细胞内ATP含量明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。MTT结果表明，给予5,10或者20μM处理48h后，TFAMsiRNA+OTA处理组的细胞活力明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)。综上结果表明：敲低TFAM表达后，线粒体质量和mtDNA拷贝数发生了下降，而且线粒体功能损伤更明显，细胞活力下降更显著。
4干扰NRF1表达对OTA作用的影响
对GES-1细胞进行ControlsiRNA及NRF1siRNA转染，RT-PCR结果及Westernblot结果显示，NRF1siRNA可以显著降低NRF1在mRNA和蛋白水平的表达(P＜0.05)。Westernblot检测结果显示，NRF1siRNA+OTA处理组的TFAM表达明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.05)，说明OTA诱导的TFAM表达上调由NRF1介导。对细胞进行MitoTracker染色，并应用流式细胞仪检测荧光强度，结果显示：NRF1siRNA+OTA组的MitoTrackergreen荧光强度明显低于ControlsiRNA+OTA处理组(P＜0.0.5)。说明敲低NRF1表达线粒体质量明显下降。
小结：
1.短期OTA处理激活了AMPK/PGC-1α/NRF-1/TFAM通路，促进了线粒体生物合成。
2.通过siRNA干扰TFAM的表达可以导致线粒体质量及mtDNA拷倍数下降，细胞内ATP及ΔΨM下降更明显，同时细胞活力下降更多，说明促进线粒体生物合成对GES-1细胞起了一定的保护作用。
结论：
1.OTA导致GES-1细胞内ROS升高，造成线粒体功能障碍，导致线粒体膜电位下降及ATP含量减少。
2.OTA导致GES-1细胞发生了线粒体途径相关凋亡及自噬性细胞死亡。Caspase抑制剂或者自噬抑制剂可以一定程度上抑制OTA造成的细胞活力下降。
3.OTA导致GES-1细胞发生了依赖Parkin的线粒体自噬，通过ParkinsiRNA抑制线粒体自噬可以改善细胞活力。
4.OTA在GES-1细胞中引起线粒体自噬的同时，激活了AMPK/PGC-1α/NRF-1/TFAM通路，促进了线粒体生物合成。
5.使用siRNA敲低TFAM表达，可以导致线粒体质量下降，线粒体功能障碍更严重，细胞活力下降更明显，线粒体生物合成对GES-1细胞起了一定的保护作用。