抗原的交叉递呈对于诱导肿瘤或病毒特异性免疫应答至关重要。我们前期研究证实：来源于肿瘤细胞的自噬小体(DRibbles)是肿瘤抗原的有效载体,能充分激活树突状细胞(DC)并显著提高其交叉递呈肿瘤抗原的能力,进而诱导具有治疗效果的抗肿瘤免疫应答。肿瘤细胞的DRibbles目前已进入临床应用研究。HBV主要感染肝细胞,由于肝细胞缺乏共刺激分子,直接提呈HBV抗原途径不能有效诱导CD8+T细胞的活化；因此,专职抗原递呈细胞的交叉提呈被普遍认为是诱导HBV特异性CD8+T细胞应答的重要途径。在慢性HBV感染过程中,机体存在HBV特异性免疫应答能力的受损状态,而感染机体针对HBV抗原缺乏有效的交叉递呈可能是引起HBV感染慢性化的原因之一。本研究拟提取转染HBV全长基因组的HepG2.2.15细胞的自噬小体(HBV+ DRibbles),探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗效果及其免疫机制。目的以HepG2.2.15细胞来源的自噬小体作为HBV疫苗,以高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒的C57BL/6小鼠作为HBV感染的动物模型,探讨HBV+ DRibbles疫苗对HBV感染的预防和治疗作用及其免疫机制。方法1.HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1不同药物(Rapamycin, Bortezomib, NH4CI)处理对数生长期HepG2.2.15细胞,差速离心法提取自噬小体(HBV+ DRibbles);1.2 Western blot法检测不同药物处理组的HepG2.2.15细胞裂解液中HBsAg、LC3的水平以及HBV+ DRibbles中LC3的水平；1.3透射电子显微镜观察HBV+ DRibbles的形态；1.4 ELISA法检测HBV+ DRibbles中HBV抗原的相对含量。2.HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究重组HBsAg蛋白疫苗免疫野生型(Wild type,WT) C57BL/6小鼠,以表面抗体(anti-HBs)阳性小鼠的淋巴细胞作为HBsAg特异性细胞,体外用HBV+ DRibbles和HBsAg再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量；进一步分选出HBsAg特异性的CD4+和CD8+T细胞,体外分别用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激,ELISA法检测培养上清中IFN-y的含量。3. HBV+ DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,并设HBV-DRibbles疫苗对照组。于免疫第8天,体外HBV抗原及抗原肽再刺激小鼠淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献中报道的方法将pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,于质粒注射后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBV抗原的相对含量,荧光定量PCR法检测血清HBVDNA的拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST的水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达,HE染色法观察肝组织的病理变化。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究以不同剂量的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒。于免疫14天后ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.1以30μg的HBV+ DRibbles疫苗淋巴结免疫WT C57BL/6小鼠,第8天高压尾静脉注射pAAV/HBV1.2质粒,同时设未免疫PBS对照组。在质粒注射同一天,疫苗免疫小鼠腹腔分别注射单克隆抗体,分组如下：注射PBS组、注射αCD4单克隆抗体组、注射αCD8单克隆抗体组、注射αCD4+αCD8单克隆抗体组。于免疫后第14天,ELISA法检测血清HBeAg水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例；6.2以HBV+DRibbles疫苗免疫WT C57BL/6小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,同时设正常小鼠的肝细胞作为对照。分别于培养不同时间点采用全自动生化仪酶法检测培养上清中ALT、AST的水平,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的含量。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WTC57BL/6小鼠,以小鼠感染HBV的初期模拟急性HBV感染阶段。7.1于质粒注射第3、5、7天,HBV+ DRibbles疫苗免疫HBV急性感染小鼠,并设PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；7.2相同分组与免疫,于免疫后不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBeAg、HBsAg、抗HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测血清HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。8. HBV+ DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究pAAV/HBV1.2质粒高压尾静脉注射WT C57BL/6小鼠,以持续感染HBV达60天后的HBsAg耐受小鼠作为HBV慢性感染模型。8.1 HBsAg耐受小鼠的判定WT C57BL/6小鼠分为两组,一组按照前述方法建立模型,于质粒注射后第61、63、65天,重组HBsAg蛋白疫苗免疫HBsAg阳性小鼠；另一组小鼠按相同方案免疫。两组小鼠于免疫后第14天,ELISA法检测血清抗HBs抗体水平；8.2耐受小鼠以血清HBsAg水平分组,设HBV+ DRibbles疫苗免疫组、PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组。于质粒注射第61、63、65天免疫治疗。于首次免疫第8天,HBV抗原及抗原肽体外再刺激淋巴细胞,ELISPOT法检测分泌IFN-γ细胞的数量；8.3相同分组与免疫,于首次免疫第8天,收获淋巴细胞,分别尾静脉过继转移到新一批慢性HBV感染小鼠及对照组小鼠体内。于过继转移后的不同时间点,ELISA法检测小鼠血清HBsAg、anti-HBs抗体水平,荧光定量PCR法检测HBV DNA拷贝数,全自动生化仪酶法检测血清ALT、AST水平,免疫组织化学技术检测肝细胞内HBcAg的表达并计数HBcAg+肝细胞比例、HE染色观察肝组织的病理变化。结果1. HBV+ DRibbles的制备和鉴定1.1差速离心法提取不同药物处理组的HBV+ DRibbles,分装,-20℃保存；1.2各组细胞裂解液中均检测到分子量26KD的HBsAg的表达,3种药物联合处理组含量最高；加入Bortizomib组均出现分子量<26KD的HBsAg小片段,3种药物联合处理组的小片段更为明显。各组细胞裂解液中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,以胞浆型LC3-Ⅰ为主,3种药物联合处理组中LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ含量最高；各组HBV+ DRibbles中均检测到自噬特异性标记物LC3分子,且以膜结合型LC3-Ⅱ为主,3种药物联合处理组LC3-Ⅱ含量最高；1.3 3种药物联合处理组的HepG2.2.15细胞自噬小体(HBV+DRibbles),具有双层膜结构,直径100-1000nm；1.4与培养液对照组相比,3种药物联合处理组的HBV+ DRibbles中HBsAg和HBeAg含量明显升高。2. HBV+ DRibbles诱导DC细胞交叉递呈HBV抗原的实验研究HBV+ DRibbles作为富集HBV抗原的载体,体外再刺激HBsAg特异性淋巴细胞,与HBsAg蛋白刺激组相比,培养上清中能够产生更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。进一步用HBV+ DRibbles、HBsAg负载的DC细胞再刺激HBsAg特异性CD4+、CD8+T细胞,与未负载抗原的对照组及负载HBsAg的DC细胞刺激组相比,负载HBV+ DRibbles的DC细胞刺激组均产生了更高水平的IFN-γ,差别具有统计学意义。3. HBV+DRibbles疫苗诱导HBV特异性细胞免疫应答的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,效应淋巴细胞经HBV抗原及抗原肽再刺激,与其他剂量组相比,30μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量最高,差别具有统计学意义；与未免疫的PBS对照组相比,10μg与100μg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg及HBcAg特异性IFN-γ的细胞数量均未见明显统计学差异；30νg HBV+ DRibbles免疫诱导产生的分泌针对HBsAg、HBcAg及相关肽特异性IFN-γ的细胞数量明显高于30μg HBV- DRibbles免疫组,差别具有统计学意义。4.HBV感染小鼠模型的建立以文献报道的方式,复建HBV感染的小鼠模型,于质粒注射后不同时间点,检测小鼠HBV感染状态。与未注射对照组及PBS注射对照组相比,质粒注射组小鼠血清ALT水平均未见明显统计学差异；而AST水平只在质粒注射后第3天显著高于未注射对照组,其余时间点未见明显差异。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高水平的HBsAg及HBeAg含量,随着观察时间的延长,含量逐渐降低；至第63天,部分小鼠血清中HBsAg及HBeAg已经低于检测下限。质粒注射第3天,所有小鼠血清均可检测到较高的HBV DNA水平(180.9±98.61×104 copies/ml),至第63天,HBsAg阳性小鼠的血清仍可检测到HBV DNA (102×104,34.1×104 copies/ml)。质粒注射第3天,WT小鼠的肝组织结构正常,无病变；PBS注射组可见轻度的点状或小灶状坏死,局部可见少量中性粒细胞和单核-巨噬细胞的浸润；质粒注射组小鼠的肝细胞出现中度坏死,中央静脉区可见少量中性粒细胞浸润,至第7天,肝脏组织结构基本恢复正常,至第63天,亦未见明显病变。质粒注射第63天,HBsAg阳性小鼠的肝细胞中可检测到HBcAg表达,HBcAg既可分布于细胞浆,亦可分布于细胞核。5. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的实验研究不同剂量的HBV+ DRibbles及HBV- DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,于第8天注射质粒。质粒注射后不同时间点,与其他剂量组相比,30μgHBV+ DRibbles免疫组的小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显著降低,具有统计学差异。与未免疫的PBS对照组相比,10μg、100μg HBV+ DRibbles疫苗及HBV- DRibbles疫苗免疫组的小鼠上述指标均未见明显变化。6. HBV+ DRibbles疫苗预防HBV感染的机制研究6.130μg HBV+ DRibbles免疫WT C57BL/6小鼠,设PBS对照组；第8天注射质粒,同时免疫组小鼠腹腔注射单克隆抗体以清除相应T细胞。结果可见：与PBS对照组相比,未清除T细胞的HBV+ DRibbles免疫组小鼠血清HBeAg水平、HBV DNA拷贝数及肝细胞HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均显著下降；只清除CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标与PBS对照组相比,未见明显统计学差异；同时清除CD4+和CD8+T细胞的免疫组小鼠上述指标相对于只清除CD8+T细胞的免疫组,差异无统计学意义；6.2 HBV+ DRibbles疫苗免疫小鼠的效应淋巴细胞与质粒注射小鼠的肝细胞共孵育,结果可见：与正常肝细胞共孵育组相比,免疫小鼠淋巴细胞与HBV感染的肝细胞共孵育组培养上清中ALT、AST水平均升高,ALT水平未见统计学差异,而AST水平具有明显统计学差异；同时培养上清中产生了更高水平的IFN-γ,差异具有统计学意义。7. HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染的实验研究7.1以HBV+ DRibbles疫苗免疫急性HBV感染小鼠,效应淋巴细胞体外经HBV抗原及抗原肽再刺激。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,HBV+ DRibbles疫苗免疫诱导分泌针对HBV抗原及抗原肽特异性IFN-γ的细胞数量明显增高,差别有统计学意义；而HBsAg免疫组未能诱导产生分泌IFN-γ的细胞；7.2 HBV+ DRibbles疫苗治疗急性HBV感染小鼠。结果可见：与PBS及重组HBsAg蛋白疫苗免疫的对照组相比,只有HBV+ DRibbles疫苗免疫能够明显降低小鼠血清HBeAg、HBsAg、HBVDNA水平、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例；而小鼠血清HBsAg的水平明显低于PBS对照组,高于HBsAg免疫组；部分小鼠血清产生抗HBs抗体,但平均水平明显低于HBsAg免疫对照组；且小鼠血清ALT、AST水平未见明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量炎细胞浸润。8. HBV+DRibbles疫苗治疗慢性HBV感染的实验研究8.1经重组HBsAg蛋白疫苗免疫后,WT小鼠血清产生了高水平的anti-HBs抗体,而pAAV/HBV1.2质粒注射后60天的模型小鼠血清中anti-HBs抗体阴性；8.2 HBV、DRibbles疫苗免疫HBsAg耐受小鼠,同时设PBS及HBsAg蛋白疫苗免疫对照组,体外HBV抗原及抗原肽再刺激各组小鼠效应淋巴细胞。结果可见：与PBS对照组相比,只有HBV+DRibbles疫苗免疫组小鼠的淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激时,能够产生更高水平分泌IFN-γ的细胞数量,差异具有统计学意义；而重组HBsAg蛋白疫苗免疫组的小鼠淋巴细胞在HBV抗原及抗原肽再刺激后,分泌IFN-γ的细胞数量未见明显统计学差异；8.3 HBV、DRibbles疫苗治疗HBsAg耐受小鼠。结果可见：与PBS对照组及重组HBsAg蛋白疫苗免疫对照组相比,只有接受HBV+DRibbles免疫组淋巴细胞过继转移后,被过继转移小鼠血清中HBsAg水平、HBV DNA拷贝数、肝细胞内HBcAg的表达及HBcAg+肝细胞比例均明显降低,差异具有统计学意义,部分小鼠产生抗HBs抗体；被过继转移组小鼠血清ALT、AST水平无明显变化,肝组织结构基本正常,仅有少量小灶性坏死和炎细胞浸润。结论HBV+ DRibbles疫苗能够高效募集HBV抗原成份；作为HBV抗原的有效载体,能够有效活化DC细胞并交叉递呈HBV抗原；HBV+ DRibbles疫苗免疫能够诱导HBV特异性的细胞免疫应答,并有效预防HBV感染,其中,CD8+T细胞在抑制HBV病毒复制及清除HBV感染的肝细胞中发挥重要作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染急性期能够诱导多种HBV抗原及抗原肽特异性的细胞免疫应答、抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV急性感染具有明显的治疗效果；HBV+ DRibbles疫苗免疫在HBV感染慢性期能够打破免疫耐受、诱导HBV多特异性的细胞免疫应答,抑制HBV的复制、清除HBV感染的肝细胞,对HBV慢性感染具有明显的治疗作用；HBV+ DRibbles疫苗免疫对HBV急性和慢性感染的治疗未造成小鼠肝细胞明显的免疫病理损伤。提示HBV+ DRibbles疫苗在治疗HBV感染方面具有潜在的应用前景。