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寡糖因其独特的结构而成为重要的生命物质,随着分子生物学和细胞生物学的快速发展,寡糖的生物学活性和功能不断得到揭示,同时也引起人们越来越多的关注,因此寡糖将会有广阔的应用空间和市场前景。寡糖的制备有化学法、物理法和生物酶法。其中,酶法反应条件温和,选择性较好,是理想的寡糖制备方法。本文以黄原胶为原料,采用生物酶法制备出一种新型寡糖,并对该黄原胶寡糖的生物活性进行了初步研究。主要研究内容如下:
利用实验室分离纯化出的黄原胶降解菌Paenibacillus lautus XD2-8,以黄原胶为底物摇瓶培养,通过测定发酵温度、pH、摇瓶装量、底物浓度、种龄对发酵液的菌体密度和相对酶活力的影响,确定该菌的最佳产酶条件。实验结果表明:发酵产黄原胶降解酶的最佳条件为温度30 ℃,初始pH 为7.5(灭菌前),摇瓶装量为80mL,底物浓度为10g/L,摇床转速为200r/min,接种的适宜种龄为36~42h,接种量对发酵产酶影响不大。在黄原胶降解菌(Paenibacillus lautus)XD2-8的最佳产酶条件下,发酵培养制备黄原胶降解酶,并对其酶学特性做了初步的研究。结果显示,该酶的最优酶促反应条件为:温度为35℃、pH 值为6.0、底物浓度为5g/L;葡萄糖对该酶促反应具有抑制作用,且葡萄糖浓度越大抑制作用越强。
然后利用该黄原胶降解酶对黄原胶进行降解,通过测定温度、pH、酶解时间、底物浓度和加酶量对制备黄原胶寡糖生物活性(羟基自由基清除率、超氧自由基清除率和DPPH 自由基清除率)的影响,确定该酶制备黄原胶寡糖的最佳工艺条件。
结果显示:具有清除羟基自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是35℃,pH 值为6.2,酶解时间是5h,底物浓度为4g/L,于80mL的黄原胶溶液中加入10ml 粗酶;
具有清除超氧自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是33 ℃,pH 值为6.0,酶解时间是5h,底物浓度为6g/L,于80mL的黄原胶溶液中加入9mL 粗酶;具有清除DPPH 自由基活性的黄原胶寡糖的最适制备温度是33 ℃,pH 值为6.2,酶解时间是8h,底物浓度为3g/L,于80mL的黄原胶溶液中加入8mL 粗酶。
最后对上述三种寡糖样品进行了初步提纯,通过高效液相色谱仪初步测定其分子量。结果表明:清除羟基自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为1000;清除超氧阴离子自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为900;清除DPPH 自由基活性最强的黄原胶寡糖的分子量约为670。