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生命是一个通过氧化还原对快速传递电子传递的过程,氧化还原反应是信号转导的重要组成部分,它决定着细胞的命运。电子传递控制着重要的生物化学过程,比如光合作用以及细胞色素P450调节的氧化。小分子探针以及遗传密码子扩展方法设计生物传感器为定量化研究细胞内的氧化还原反应提供了工具。通过体外化学修饰对绿色荧光蛋白标记一个氧化性的小分子,使得荧光蛋白的荧光强度响应环境中的氧化还原环境,得到高灵敏度且高特异性的氧化还原探针。 在本论文中通过基因定点突变的方法将绿色荧光蛋白原有的两个半胱氨酸去除,在发色团附近特异位点引入半胱氨酸,选取合适的反应条件,特异性的标记上了小分子2,3-二甲氧基-5甲基苯醌(DMBQ),发现在DMBQ处于氧化态时,绿色荧光蛋白的荧光发生淬灭,这种淬灭的机理是基于光致电子转移,并且通过了时间分辨荧光测定了这一过程中的电子传递速度。 本论文中设计了一种氧化还原的荧光探针可以有效监测体外的氧化还原环境。首先向绿色荧光蛋白的表面共价连接了一个氧化性的DMBQ,证明了DMBQ可以做为电子的受体接受绿色荧光蛋白发色团上的电子。通过还原剂将DMBQ还原,荧光得以恢复。 本论文的第二部分是非天然氨基酸的筛选和遗传密码扩展的方法设计荧光蛋白。这种方法对于体内和体外蛋白质的结构和功能的研究都是一种强有力的工具。通过非天然氨基酸筛选的方法获得了萘酚丙氨酸合成酶,通过遗传密码子扩展的方法可以将萘酚丙氨酸插入到荧光蛋白质中发色团66位酪氨酸中,使得荧光蛋白的激发和发射峰发生了红移。这些红移的GFP突变体对于细胞中蛋白质的定位,组织成像以及对于荧光共振能量转移的传感器设计都是非常有用的。