论文部分内容阅读
目的:以丝素蛋白（silk fibroin,SF）和明胶（gelatin,GN）作为基体材料,通过冷冻干燥、交联法制备负载磷酸氢锶（Sr HPO4,Sr P）的SG复合多孔支架,并对支架的理化性能进行表征,及检验其对小鼠骨髓间充质干细胞（Mouse bone marrow mesenchymal stem cells,m BMSCs）成骨分化能力和RAW264.7细胞破骨分化能力的影响,为体内骨质疏松骨缺损修复的动物实验打下基础及为其临床应用提供理论依据。方法:（1）支架的分组及理化性能表征:单纯的SG支架;Sr P/SG比例为5、10和15 wt%的支架分别标记为5Sr P/SG,10Sr P/SG和15Sr P/SG支架。使用傅里叶红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）测定支架的组成结构,使用扫描电镜（Scanning electron microscopy,SEM）观察支架的形貌,使用动态力学试验机测量支架的力学性能,并通过将支架浸泡在磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer,PBS）中检测支架的膨胀行为和降解行为。（2）支架对m BMSCs成骨分化能力的影响:使用Live-dead细胞染色试剂盒对Sr P/SG支架上的m BMSC进行染色,并用荧光显微镜观察细胞的存活情况;使用CCK-8试剂对m BMSC在Sr P/SG支架上培养1、7和14天后的增殖情况进行定量;通过将碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）含量相对于总蛋白含量归一化,来定量评估ALP活性;进行逆转录聚合酶链反应（Quantitative real-time PCR,q PCR）测量成骨相关基因的表达情况;（3）支架对RAW264.7细胞破骨分化能力的影响:使用酒石酸抗性酸性磷酸酶（Tartaric acid resistant acid phosphatase,TRAP）检测试剂盒对TRAP活性进行定量检测,使用TRAP染色试剂盒对TRAP进行染色;通过q PCR测定抗破骨细胞生成相关基因的表达。结果:（1）SEM图像显示所有支架具有多孔结构,大部分孔隙在100μm左右;FTIR光谱显示各组支架的主要分子基团为氢氧键（-OH）、酰胺I、II和III;支架的应力-应变曲线表明,5Sr P/SG和10Sr P/SG支架的抗压强度与SG支架几乎相同,15Sr P/SG支架的抗压强度明显高于SG支架;当Sr P的复合量为10 wt.%和15 wt.%时,支架的吸水率降低;而随着Sr P含量的增加,支架的膨胀率增加;Sr P的掺入,提高了失重率;在28天后,15Sr P/SG支架的失重率明显高于SG支架的。（2）Live-dead细胞染色的荧光图像表明,m BMSCs在所有支架上都具有良好的活力;在7天和14天时,所有Sr P/SG支架上的细胞数量显著高于SG支架,15Sr P/SG组的ALP活性也显著高于SG支架;q PCR结果显示,与其它组相比,15Sr P/SG组ALP、Runx2、Col-I和OC基因的表达量更高。（3）与SG浸提液相比,Sr P/SG浸提液中的破骨细胞样细胞较少,TRAP活性较低;基因表达上,三种Sr P/SG浸提液中的细胞表达的TRAP、MMP9、CTK基因量均明显低于SG浸提液中的。结论:成功制备了具有合适孔径、降解性能、能持续释放Sr、良好细胞相容性,并且能促进细胞成骨分化和抑制细胞破骨分化的含锶丝素蛋白-明胶复合多孔支架,为下一步开展动物体内骨质疏松骨缺损修复实验提供了理论依据。