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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea viruse,PEDV)引起的一种急性肠道疾病,以呕吐、水样腹泻为主要特征,严重时可引起病猪死亡。1978年,该病首次在英国和比利时被报道,此后欧洲、亚洲的多个国家相继报道了PED的发生与流行。近几年,一种变异的PEDV在我国猪群中开始流行,并引起七日龄以内新生仔猪严重腹泻和高死亡率,本研究从腹泻仔猪的肠道组织成功分离到一株PEDV流行毒株,测定了其全基因组序列,并初步建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法和基于单克隆抗体的竞争性ELISA方法。具体研究内容如下:1、PEDV的分离鉴定与全基因组分析本试验通过尝试多种细胞、培养系统和培养条件,成功分离出一株猪流行性腹泻病毒。通过间接免疫荧光试验(IFA)、全基因组克隆、同源性比较和系统进化树分析等证实该分离株是目前广泛流行的变异PEDV,暂时命名为SH6株,属于Group II。全序列分析证明该病毒的基因组大小为28,038 bp,从5’端至3’端,编码蛋白依次是多聚蛋白(6,781 aa),S蛋白(1,386 aa),ORF3蛋白(224 aa),E蛋白(76 aa),M蛋白(226 aa)和N蛋白(441 aa)。2、PEDV N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的初步建立为建立猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA检测方法,本研究从新分离PEDV流行毒株(JS-2013)中扩增其N基因,并将N基因克隆至p Cold-I DNA原核表达载体中,构建p Cold-I-N重组质粒,经过IPTG诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立PEDV间接ELISA检测方法,并且对各种检测条件进行优化,优化后确定N蛋白最佳包被条件为37℃包被2 h,最佳抗原包被量为200 ng/孔,最佳封闭条件为5%脱脂乳37℃封闭2 h,最佳血清稀释度为1:200,血清最佳孵育时间为37℃孵育20 min,二抗最适稀释度为1:2×104,二抗最佳孵育时间为40 min,临界值为0.345~0.394,介于两者之间为可疑。并对50份已知背景血清进行检测,符合率达94%。该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了依据。3、抗N蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的初步建立将纯化的重组N蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,运用杂交瘤细胞筛选技术最终获得1株稳定分泌抗PEDV N蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为:2B8。扩大培养该杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠,制备腹水。经鉴定,腹水效价在105以上。Western blot和IFA试验结果显示该单克隆抗体具有良好的反应性和特异性。与其他猪源病毒无交叉反应。将获得的单克隆抗体作为竞争一抗初步建立竞争ELISA检测方法。并对工作条件进行优化,确认最佳工作条件和阴阳性判定临界值。其中阴性血清临界值=X+2SD=33.2%,阳性血清临界值=X+3SD=38.6%,介于两者之间为可疑。本试验初步建立的两种检测PEDV抗体的ELISA方法,为PEDV变异株感染的诊断及其流行病学分析奠定了重要的基础。