亚临界水辅助酶解鲍鱼内脏提取物及其体外活性的研究

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本研究以鲍鱼内脏为原料,使用亚临界水萃取并辅助酶解制备鲍鱼内脏酶解物,并对鲍鱼内脏亚临界水萃取物(AVS)及其辅助酶解物(AVSEs)的理化性质及其抗氧化活性进行测定。之后,本研究通过RAW264.7细胞对AVS和AVSEs的体外免疫活性进行测定。最后,本研究使用Caco-2细胞模型对AVS和AVSEs的体外转运吸收情况及转运吸收后的抗氧化活性进行测定。首先,本研究使用亚临界水分别辅助木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶酶解制备水解物。对其基本成分进行测定后结果表明,AVS中蛋白质和总糖含量分别为38.33%和24.36%。当亚临界水萃取物被进一步酶解时,不论采用哪一种酶,其蛋白质含量增加而总糖含量减少。氨基酸主要由丙氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成。亚临界水萃取物的Fe3+还原能力、DPPH、ABTS、DMPD和OH自由基清除活性的IC50值分别为2.93、1.48、1.61、3.72和5.51mg/mL。在经过进一步酶解后,IC50值均出现下降。其中,使用木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解后得到的辅助酶解物DMPD和OH自由基清除活性较高,而脂质过氧化抑制率、DPPH和ABTS自由基清除活性则相反。结果表明,使用酶解可以提高亚临界水萃取物的抗氧化活性,其抗氧化活性的提高程度与所使用的蛋白酶的种类有关。其次,本研究对AVS和AVSEs的体外免疫活性进行测定。AVS对RAW264.7细胞增殖活性以及吞噬活性具有促进作用,而对LPS诱导的RAW264.7细胞吞噬活性无显著性作用。经过酶解后,除AVSE-B外,AVSEs对RAW264.7细胞增殖活性、吞噬活性以及LPS诱导的RAW264.7细胞吞噬活性促进作用增强。其中AVSE-N对小鼠巨噬细胞增殖活性的促进作用达到37%。此外,AVS对RAW264.7细胞以及LPS诱导的RAW264.7细胞的TNF-α分泌活性具有抑制作用而对IL-10分泌活性具有促进作用。经过酶解后,AVSE-P、AVSE-B和AVSE-F对TNF-α分泌活性以及IL-10分泌活性均具有促进作用且促进作用增强。而AVSE-N对TNF-α分泌活性依然具有抑制作用且抑制作用增强。此外,AVS和AVSEs均可以通过抑制iNOS活性来抑制细胞NO的分泌。因此,使用亚临界水辅助酶解鲍鱼内脏制备的水解物具有良好的体外免疫活性,可以起到一定的消炎作用。最后,本研究使用Caco-2单细胞膜模型对AVS以及AVSEs的转运吸收情况进行探究。接种Caco-2细胞接种于Transwell小室中连续培养21天后,细胞间紧密连接形成单层细胞膜,TEER值达到501.25Ω·cm2,AP侧碱性磷酸酶含量达到2.67金氏单位/100 mL,细胞转运模型成功建立。对AVS和AVSEs进行体外转运吸收实验后,测定其抗氧化活性。AVSE-N和AVSE-F表现出的总抗氧化能力高于AVSE-P和AVSE-B。且AVSE-N中还原型谷胱甘肽以及超氧化物歧化酶含量最高,而丙二醛含量最低。因此,AVSE-N在经过转运吸收后依然表现出最好的抗氧化活性。实验结果表明,使用亚临界水辅助酶解萃取鲍鱼内脏,所得的抗氧化水解物可以用于保健品和制药工业。
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