近年来，减毒细菌活载体因其能够刺激机体产生针对活载体及其携带的外源抗原的体液、细胞免疫和局部粘膜免疫受到人们的广泛关注，特别是近期研究结果证明许多活细菌载体能够作为DNA疫苗的运送载体，可以通过口服减毒细菌进入机体，从而诱导产生针对特定抗原的各种免疫应答。但迄今为止对活疫苗载体与宿主免疫系统间相互作用规律及其调控机制知之甚少，这方面的免疫生物学研究对于研制新型基因工程疫苗将会提供重要的理论依据，且对相关疾病的免疫防制有着重要的指导价值。因此我们构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的减毒鼠伤寒沙门氏菌，阐明其在体内、外感染试验的动态分布及它与抗原呈递细胞的相互作用规律，这为沙门氏菌疫苗载体及相关基因工程疫苗的研究奠定了理论基础。 1 表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定 应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)。用EcoRI和NcoI将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下，克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRI和NcoI位点之间，构建成重组表达质粒pYAGFP，然后依次转化大肠杆菌X6212、中间宿主X3730、终末宿主X4550。X4550于LB培养基上呈绿色，在荧光显微镜下观察，细菌整个菌体发绿色荧光。在体外稳定性试实验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色，证明构建的减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB／c小鼠后，观察一个月未见有异常现象，同时剖检后也未见脏器有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究重组沙门氏菌免疫生物学特性研究提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中也有重要应用价值。扬州大学博士论文2重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学 用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)通过尾静脉接种BALB/。小鼠，在不同时间，无菌取同一小鼠的肝脏、脾脏两种组织，经剪切、研磨、稀释后涂布于LB平板，培养后计数。同时眼部采血，制备血清，以X4550(pYAGFP)包被酶标板，用间接ELISA法测血清中抗细菌的抗体，结果表明，重组菌在这两个脏器中的数量有两个时间高峰，总的趋势是越来越少，静脉注射后约41天仍能从肝脏脾脏中分离到重组菌，这对携带外源抗原的载体激发机体产生足够的免疫应答十分有利;而血清中抗体，随时间的推移，效价越来越高，说明经静脉注射途径，可以产生较高的抗载体菌的体液免疫应答。在静脉注射后11一13天细菌数量达到一个高峰，刺激机体产生应答，使抗体滴度逐渐升高，而此时细菌数量由于被抗体中和，呈下降趋势，至17天时降至谷底，此时抗体滴度呈平缓上升阶段。随后细菌数量逐渐增多，刺激抗体滴度迅速升高，抗体效价于21天时达到一个高峰，至23天时细菌数量达到第二峰值，抗体效价开始下降，然后又逐渐上升，此时细菌数量一直在下降，而抗体效价一直在上升。因此可以初步推断，细菌数量与血清中抗细菌的抗体呈一定的相关性。 另用相同的细菌口服接种BALB/c小鼠，在不同的时间，分别无菌取肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结和小肠派伊尔结(Peyer’5 patches，PPs)，经剪切、研磨后全部涂布于LB固体培养基上以计数，同时眼部采血以制备血清，以x4550(pYA3334)、x4550 (PYAGFP)和初步纯化的GPP包被酶标板，用间接EL工SA法测血清中抗细菌的抗体，结果表明，随时间的推移，重组菌数量呈现正态分布的变化趋势，即开始和末尾数量少，中间数量多。口服后，各脏器细菌约于10一巧天呈现最高峰值，在此过程中抗体效价在逐渐上升，约到加天时抗体效价达到最高值，然后细菌数量的迅速递减至清除，而抗体效价呈缓慢下降趋势。说明在机体免疫系统的作用下，细菌会被逐渐清除于体外。有趣的是，口服途径的PPs细菌数量与血清中抗细菌的抗体呈一定的相关性，而脾脏、肝脏及肠系膜中细菌数量与血清中抗细菌的抗体滴度无关，这些结果为载体菌构建与应用提供了必要的认识。3重组减毒鼠伤寒沙门氏菌与抗原呈递细胞的相互作用 为了明晰减毒鼠伤寒沙门氏菌与抗原呈递细胞间的相互作用，首先在体外用表达绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)感染巨噬细胞系、树突细胞系以及腹腔巨噬细胞，在感染后2、4、6、9、12、24小时，用荧光显微镜观察感染情况，发现巨噬细胞具有很强的吞噬能力，随着时间的延长，大部分细胞被感染，而且细菌逐渐在细王芳:表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其免疫生物学特性胞内分裂繁殖;而树突细胞系吞噬细菌的能力有限，仅有一部分细胞感染了细菌，随时间推移，细胞感染数量变化不大，而腹腔巨噬细胞的吞噬能力比巨噬细胞系还要强，这与巨噬细胞是主要吞噬细胞的性质一致。将感染细胞作透射电镜观察，结果显示，巨噬细胞较活跃，有许多伪足，细胞器发达?