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葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)普遍存在于动物、植物和微生物中,能够将葡萄糖氧化生成葡萄糖醛酸,在食品、医药和工业生产等方而应用广泛。本实验在毕赤酵母表达系统中成功表达GOD,且通过整合分子伴侣及优化5L发酵罐发酵条件进一步提高目的蛋白的表达,最后通过计算机模拟设计突变的方法获得突变点提高GOD的热稳定性。主要结论如下：成功构建了毕赤酵母表达菌株X33/pPIC9k-GOD。将二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase, PDI)和透明颤菌的血红蛋白(Vitreoscialla hemoglobin, VHb)单独及同时整合进X33/pPIC9k-GOD中,在摇瓶中使GOD酶活分别提高了120%、40%和150%,活力分别达到29U/mL、18U/mL和33 U/mL。X33/pPIC9k-GOD菌株在5L发酵罐中的下罐酶活达到302 U/mL,蛋白浓度2.7 g/L,而整合了分子伴侣的菌株X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb下罐酶活达到603 U/mL,蛋白浓度6.1g/L研究了X33/pPIC9k-GOD菌株的发酵过程,优化了其在5L发酵罐上的部分发酵工艺。得到GOD优化后的发酵条件：诱导pH 6.0、诱导温度为30℃、在诱导90 h时添加1mMVB2、采用20：1(W/W,甲醇：山梨醇)甲醇/山梨醇混合碳源诱导。X33/pPIC9k-GOD菌株采用优化后的发酵条件GOD下罐酶活为456 U/mL蛋白浓度为5.1g/L; X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb菌株下罐酶活达到716U/mL,蛋白浓度为7.4 g/L。利用计算机辅助设计突变方法得到3个氨基酸突变位点S16K、Q243 H和H477Y,以X33/pPIC9k-GO D为模板构建突变菌株,使GOD的热稳定性分别提高2℃、1.5℃和2℃,达到60.5℃、60℃和60.5℃。S16K和H477Y两个突变点对GOD的活性没有影响,Q243H突变体使GOD活性提高了20%,活力达到15 U/mL,比活力没有提高。将3个突变位点叠加,构建菌株X33/pPIC9k-GOD/mut3,按照优化后发酵条件在5L发酵罐中进行高密度发酵,下罐酶活达到504 U/mL,蛋白浓度为5.8g/L,热稳定性达到63℃(提高4.5℃)。