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目的1、在食管鳞癌细胞系中,观察DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)抑制剂NU7441对肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。2、观察DNA-PKcs通路被抑制后,其他DNA损伤修复通路及细胞周期检查点相关蛋白变化,包括同源重组修复通路(HR)蛋白FANCD2、碱基切除修复通路(BER)蛋白PARP1、核苷酸切除修复通路(NER)蛋白RRM1、细胞周期检查点相关蛋白WEE1。3、探讨mi R-126、miR-101、miR-21在食管鳞癌细胞放射损伤中的作用,及其和DNA-PKcs之间的关系。方法1、彗星实验检测诱导DNA断裂的药物伊立替康对食管鳞癌细胞株DNA的损伤。2、采用MTT法检测伊立替康联合NU7441(DNA-PKcs抑制剂)对食管鳞癌细胞EC109的增殖抑制。3、应用Western blot检测NU7441对放射照射后食管鳞癌细胞EC109中p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、PARP1、WEE1、FANCD2、RRM1蛋白表达的影响。4、采用流式细胞学检测NU7441对放射照射后食管鳞癌细胞EC109细胞周期分布与凋亡活性的影响。5、实时定量PCR检测X射线照射后食管鳞癌细胞株中miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs mRNA的表达情况。6、收集2015年9月至2016年3月河南省肿瘤医院食管鳞癌患者放疗前外周血标本24例,健康体检者外周血5例,实时定量PCR检测放疗前食管鳞癌患者外周血中miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA的表达情况。7、数据统计分析:用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理,每个指标至少重复检测3次,先进行正态性及方差齐性检验,若符合正态性且方差齐,则应用单因素方差分析进行组间比较,实验结果用均数±标准差来表示,应用LSD法进行两两之间比较,如果不符合正态性且方差不齐,则采用秩和检验方法,两样本之间的比较采用两独立样本t检验,miRNA与DNA-PKcs mRNA之间的相关分析采用spearman相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、采用彗星实验软件对DNA损伤图像进行分析,结果显示随伊立替康浓度增大,食管鳞癌细胞EC109尾矩、尾长都增大。2、伊立替康和/或NU7441抑制食管鳞癌细胞EC109的增殖。3、与对照组相比,NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的p-DNA-PKcs表达降低(P<0.01),放射照射组p-DNA-PKcs表达升高(P<0.01);与对照组相比,其他组食管鳞癌细胞EC109中t-DNA-PKcs表达无明显变化。4、与对照组相比,单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的WEE1和PARP1表达明显降低且联合组的WEE1和PARP1表达低于单独放射照射组(P均<0.01);与对照组相比,单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的FANCD2表达明显升高且联合组的FANCD2表达高于单独放射照射组(P均<0.05);与对照组相比,单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的RRM1表达升高,但差异无统计学意义。5、与对照组相比,单独NU7441组食管鳞癌细胞EC109 G2期无明显变化;单独放射照射组及联合组食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞,且差异有统计学意义(P均<0.05);与单独NU7441组和单独放射照射组相比,联合组食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞(P均<0.05)。6、与对照组相比,单独NU7441组食管鳞癌细胞EC109凋亡率无明显变化,而单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109凋亡率明显增加(P<0.05);与单独NU7441组和单独放射照射组相比,联合组食管鳞癌细胞EC109细胞凋亡率明显增加(P均<0.05)。7、(1)食管鳞癌细胞EC109,放射照射后mi R-126和miR-101表达升高(P<0.01);mi R-21表达有降低趋势;DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.01)。EC109细胞中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关,相关系数为-0.885(P=0.008)。(2)食管鳞癌细胞系TE7,放射照射后miR-126表达升高(P<0.01);miR-101表达降低(P<0.01);miR-21表达有降低趋势;DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.01)。(3)食管鳞癌细胞系EC9706,放射照射后miR-126表达升高(P<0.01),miR-101和miR-21表达均降低(P<0.01);DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.01)。食管鳞癌细胞系TE7和EC9706放射照射后miR-126、miR-101、miR-21表达水平与DNA-PKcs mRNA之间无线性相关(P﹥0.05);食管鳞癌细胞EC109放射照射后miR-126、miR-101表达水平与DNA-PKcs mRNA之间无线性相关(P﹥0.05)。8、放疗敏感组的食管鳞癌患者外周血中miR-101表达高于放疗不敏感组的,且差异有统计学意义(t=2.265,P<0.05);而放疗敏感组与放疗不敏感组食管鳞癌患者外周血中的miR-126、miR-21、DNA-PKcs mRNA表达差异无统计学意义。结论1、伊立替康对食管鳞癌细胞EC109 DNA损伤呈剂量依赖性。2、NU7441阻断DNA-PKcs通路,可增强伊立替康对EC109细胞增殖的抑制作用,呈浓度依赖性。放射照射可以上调p-DNA-PKcs的表达,NU7441可以下调p-DNA-PKcs的表达。放射照射联合NU7441可以使食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞,细胞凋亡率增加。3、放射照射后,用NU7441阻断EC109细胞DNA修复的非同源末端连接通路,可激活同源重组修复通路蛋白FANCD2表达。可降低WEE1蛋白表达,促进EC109细胞有丝分裂死亡。NU7441可下调碱基切除修复通路蛋白PARP1的表达。4、放射照射后EC109、TE7和EC9706细胞中miR-126、DNA-PKcs mRNA表达均上调,miR-21表达均下调。EC109中miR-101表达上调,TE7和EC9706中表达下调。EC109细胞中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。5、放疗敏感组的食管鳞癌患者外周血中mi R-101表达高于放疗不敏感组。