奶水牛是热带亚热带地区重要的产奶动物,水牛奶占世界牛奶供给量的5%以上。水牛奶的乳脂率和乳蛋白含量是荷斯坦奶牛的2.22和1.72倍。因此,研究奶水牛泌乳生理的基因调控网络可以揭示奶水牛高营养形成的分子机制。MicroRNAs(miRs)是一类非编码的19-25nt的小RNA,通过与靶基因mRNA结合阻遏靶mRNA翻译或降解靶mRNA来调控蛋白的表达。据估算,30%的蛋白编码基因受到miR的调控。研究发现miRs在动物细胞分化、增殖和凋亡过程中发挥重要作用。成年动物乳腺组织可以经历细胞增殖、分化、去分化和凋亡的循环,是研究乳腺组织泌乳和生理的理想分子机制模型。对人和小鼠的研究结果表明人的乳腺特异性miRs有23个,而小鼠的乳腺特异性miRs只有9个,表明miRs在乳腺中发挥重要作用。目前研究主要是关于miRs在其他产奶家畜泌乳生理中的作用,水牛的泌乳期和非泌乳乳腺组织miRs表达谱尚无报导。本研究首次对水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织中miRs的表达谱和作用进行了研究,构建了奶水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织的miR表达谱,分析和验证了 18个miR的差异表达模式,对筛选出的差异显著表达bbu-miR-103和novel-miR-57及其靶向基因和功能进行了研究,以便为阐明奶水牛泌乳物质及能量代谢通路的分子作用机制奠定工作基础。1.水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织miRNA差异表达谱的构建及分析采集水牛泌乳高峰期和非泌乳期(干乳期)的乳腺样本,利用Solexa高通量测序技术构建了水牛泌乳期以及非泌乳期乳腺组织2个miRNA表达谱,获得非泌乳期和泌乳期18nt-31nt的12,569,467和12,768,110条高质量序列。统计显示,中国沼泽型水牛泌乳和非泌乳期的sRNA分布的宽度模式介于18-31nt之间,在22nt达到一个高峰值,其中泌乳期乳腺组织中22nt序列占总sRNA数量的33.4%。在miRbase17.0库中检测到成熟miRs和pre-miR分别是676个和662个,归属500个microRNA基因家族。本研究在水牛乳腺组织测序确认的成熟miRs和全部pre-miR分别为359个和363个,归属为259个miRs家族;从新发现的262个候选miR中鉴定出230个水牛新miRs,其中5个是水牛特有的miRs。对所有鉴定的miRNA的第一个核苷酸偏好性分析显示,U是19nt和25nt miRs的5’端最普遍的核苷酸(94.15%和97.90%)。统计其在染色体上的分布情况,发现68.77%的已知miR和84.69%的新miR位于常染色体上,成功定位于乳腺组织染色体上的基因间隔区。已知miR主要分布在21号和X染色体,分别为74和37个占总数量的635个的11.65%和5.83%。新发现的miR,在21号和X染色体上分别为38个和32个。总miR分布在常染色体和X染色体上,密度从0.09到1.05 miRs/Mbp不等。21号染色体是miRs主要表达的染色体,分布最多,总miRs,泌乳期表达miRs和非泌乳期miRs分别为1.05个/Mbp,1.34个/Mbp和1.35个/Mbp。泌乳期和非泌乳期miRs在相同染色体上的分布密度基本相同。2.水牛泌乳期和非泌乳期乳腺组织miRs差异表达谱分析在非泌乳期,bbu-miR-148a,bbu-let-7b,bbu-let-7a,bbu-miR-21,bbu-miR-143,bbu-miR-200c,bbu-miR-26a,bbu-miR-200a 和 bbu-let-7f 是主要表达 miRs,组成了 总已知miRNA序列的53.8%,每个miRs读数大于20,000个序列,表明它们是非泌乳期组织中高丰度表达miRs。在泌乳期发现有7个高表达的miRs(bbu-let-7b,bbu-let-7a,bbu-miR-26a,bbu-miR-125b,bbu-miR-21,bbu-miR-29a 和 bbu-let-7c),每个有 20,000 多条序列表达。比较两个样品组,bbu-miR-148a,bbu-miR-143,bbu-miR-200a,bbu-miR-141 和bbu-miR-30a-5p等这些miRs在泌乳期的表达量下降到非泌乳期的一半以下。而另外一些 miR,如 bbu-miR-26a,bbu-miR-29a,bbu-miR-125b,bbu-let-7c and bbu-miR-99a 在泌乳期比非泌乳期表现出多余或等于2倍序列丰度。根据KEGG对20个差异高表达miRNA的预测靶基因进行了功能分类。结果109个预测靶基因都被标记在MAPK信号通路,其他重要途径有Jak-STAT、催乳素(PRL)信号转导和胰岛素信号通路等。3.泌乳期和非泌乳期差异表达miRNAs筛选及QRT-PCR验证差异分析两个时期miRs的表达谱,筛选出18个miRs并运用QRT-PCR对其表达量进行验证。将其分为高丰度、低丰度和未知miRs:(a)9个高表达的已知的miR:bbu-miR-30a-5p,bbu-miR-141,bbu-miR-101,bbu-miR-103,bbu-miR-148a,bbu-miR-29a,bbu-miR-125b,bbu-miR-497 和 bbu-miR-125a;(b)4 个低丰度表达的 miR:bbu-miR-490,bbu-miR-217,bbu-miR-592 和 bbu-miR-2370*;(c)5 个高表达的未知 miR:novel-miR-57,novel-39,novel-148,novel-76 和 novel-123b。QRT-PCR 验证结果显示,bbu-miR-103,bbu-miR-125a、bbu-miR-30a-5p 和 bbu-miR-148a 在泌乳期表达量高于非泌乳期,其表达量分别为非泌乳期的2.43、3.43、4.06和5.29倍(P<0.05);bbu-miR-29a在非泌乳期表达量为泌乳期的0.3倍,显著低于泌乳期(P<0.05);bbu-miR-141,bbu-miR-125b,bbu-miR-497和bbu-miR-101的表达量在泌乳期高于非泌乳期,但差异不显著(P>0.05)。低丰度的miR-490和miR-592在泌乳期表达量分别为非泌乳期的4.96和3.82倍,差异显著(P<0.05)。在高丰度表达的5个的未知miRNA中,novel-39,novel-148,novel-76和novel-123b在泌乳期和非泌乳期差异不显著(P>0.05),Novel-miR-57在泌乳期比非泌乳期高29.79倍(P<0.05)。因此,选择miR-103和novel-miR-57作为下一步主要研究对象。4.Bbu-miR-103靶向基因PANK3调控乳脂代谢的研究基于人免疫缺陷慢病毒系统的载体骨架,构建了 LPEZX-PRE-MIR-103-1前体表达克隆载体(8219 bp),携带 Bbu-miR-103 前体序列。将 LPEZX-PRE-MIR-103-1 与对空载体LPEZX-MIR-NC分别与NRF和VSVG在293T细胞中进行包装和扩繁,获得了感染滴度分别为3.42×106 PFU/mL和3.47×106 PFU/mL的复制缺陷型病毒。用组织块法培养了乳腺上皮细胞,用等量对照和miR-103病毒原液感染乳腺上皮细胞48 h后,在显微镜下观察有绿色荧光蛋白发光,表明miR-103及空载对照病毒颗粒已经成功地进入了水牛乳腺上皮细胞中,代谢产生了过量miR-103。同时化学法合成miR抑制剂并进行转染试验。结果发现过表达和抑制表达miR-103与乳腺细胞靶基因PANK3表达呈现负相关。因此,推测PANK3是水牛miR-103作用的靶基因。过表达miR-103,下调了 PANK3的表达,显著提高了 SREBP1c和ACACA的表达。测定了过表达miR-103载体对水牛脂肪代谢通路8个关键的步骤相关基因的影响。结果发现,bbu-miR-103主要作用基因范围从脂肪酸从头合成开始、延伸至甘油三酯合成、乳脂合成和分泌以及脂肪酸吸收为止,对乳脂后续的转运代谢无较大影响。5.Novel-miR-57在Bcap-37和水牛乳腺上皮细胞上的靶基因—DOK4的狩猎及验证Novel-miR-57是在泌乳期和非泌乳期乳腺组织中筛选出的相对表达量差异最大的新发现miR,但在miRBase数据库检索不到类似或同族的miR。为此,我们运用MiRscan对Novel-miR-57的二级结构进行了预测。结果显示,Novel-miR-57可能有8个茎环结构,结合自由能为-28.0kcal/mol,Novel-miR-57的成熟序列位于miR的第一个茎环上。使用自编软件ensembl(v80)注释mRNA截取3’UTR,筛选结合自由能小于-20kcal/mol的mRNA 3’UTR与miR成熟序列的5’端的2-8种子序列进行配对,找到34个水牛转录组mRNA可能是Novel-miR-57的作用靶基因。这些基因包括CYP7B1、CACNG3、DOK4、COL17A1、和 ESN1 等基因,对这些基因进行了 GO assignment和KEGG信号通路预测分析。用水牛泌乳和非泌乳期乳腺组织cDNA添加线虫miR-39作为外参进行QRT-PCR定量分析,寻找差异表达靶基因。结果发现有6个基因检测不到,RCL1、UBE3C和NFRKB等10个基因在非泌乳期和泌乳期相对表达量相似或高于泌乳期;BRMSIL、ACTL8和ADORO等11个基因在泌乳期和非泌乳期相对表达量相似或高于非泌乳期;DLX3、CANCNG3、NFKBID、C17orf53、RTN1和FBXO10等7个基因在非泌乳期表达量远高于泌乳期,分别为128.03、144.23、146.24、160.96、160.38、274.40 和 326.24 倍,差异极显著(P<0.01),可能为主要靶基因。化学合成Novel-miR-57的类似物Mimics和抑制剂Inhibitor,探讨Novel-miR-57的作用。结果发现,Bcap-37细胞系添加Novel-miR-57后能显著抑制DOK4基因的表达(P<0.01),而Inhibitor能显著提高DOK4基因的表达(P<0.01);而在水牛乳腺细胞添加100nM的Novel-miR-57后能显著促进DOK4基因的表达(P<0.01),添加200nM的Inhibitor能显著抑制DOK4基因的表达(P<0.01),与对Bcap-37细胞的作用相反。揭示了 DOK4是Novel-miR-57的作用靶基因,且Novel-miR-57能够根据不同细胞系不同生理条件来上调和下调DOK4基因的表达,最终对泌乳新陈代谢通路产生作用。结论:高差异表达Bbu-miR-103在水牛乳腺组织中的靶基因是PANK3。Bbu-miR-103通过从头合成途径促进脂肪酸合成,对水牛乳腺上皮细胞的甘油三脂合成、乳脂滴合成和分泌、脂肪酸激活等3个乳脂代谢步骤有促进作用。Novel-miR-57在Bcap-37细胞和水牛乳腺中的靶基因为DOK4,与水牛乳腺上皮细胞的分化有关。