论文部分内容阅读
非生物胁迫是影响植物生长发育的主要环境因素,是导致作物减产的主要原因。为了适应各种环境胁迫,植物在长期的进化过程中形成了各种不同的机制,以响应各种不利条件。从分子水平研究植物抗逆机制,进一步利用分子育种技术提高植物的抗逆能力具有积极意义。RD22基因最早是以受干旱或ABA诱导表达的特征基因被生物学界所认知的。AtRD22蛋白是BURP蛋白家族的典型成员之一。本课题组前期的研究表明AtRD22蛋白定位在植物的质外体中,其启动子区域具有铜响应元件,过量表达AtRD22基因能够提高拟南芥对铜离子胁迫的耐受能力。这些研究结果表明,AtRD22基因可能参与了植物耐受重金属胁迫的过程,但具体作用机制尚不明确。本研究通过探索蛋白可溶性表达的条件并纯化获得了可溶性的目的蛋白,在此基础上研究了AtRD22蛋白在体外与金属离子结合的情况,并进一步通过对-CH基序的突变,分析了AtRD22的-CH基序中半胱氨酸和组氨酸对蛋白与金属离子的结合能力的影响。具体研究结果如下:摸索了提高AtRD22蛋白在原核中可溶性表达的条件,发现SUMO促溶标签及降低诱导温度可以促进其可溶性表达。分别构建了AtRD22基因及突变了半胱氨酸或组氨酸编码位点后的基因与表达载体pSUMO的融合表达载体pSUMO-RD22,pSUMO-RD22(-cys)和pSUMO-RD22(-his),并在大肠杆菌中进行表达;利用Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化得到SUMO-RD22,SUMO-RD22(-cys)和p SUMO-RD22(-his)蛋白;利用SUMO蛋白酶ULP1进行酶切后得到AtRD22,RD22(-cys)和RD22(-his)蛋白。通过固相金属离子螯合亲和层析(IMAC)发现,AtRD22蛋白及其半胱氨酸突变蛋白可以较好的与过渡金属离子(软金属)Cu2+和Zn2+结合,与Cd2+部分结合,与硬金属离子Mg2+不结合;组氨酸位点突变后的RD22(-his)蛋白可以结合Cu2+和Zn2+结合,但不能结合Cd2+和Mg2+。研究结果显示,AtRD22蛋白的BURP结构域中的-CH基序中的组氨酸是与Cd2+等过渡金属离子结合的重要位点,但在与Cu2+和Zn2+的结合中却并非起主要作用。研究结果暗示,在参与植物铜胁迫耐受反应的过程中,AtRD22蛋白的BURP结构中的-CH基序可能并非是其主要的功能位点。