骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的发现证实了骨形成的诱导学说，为难治性骨折和骨缺损的治疗提供新的希望。从1988年Wozney首次克隆人BMP cDNA基因，至今已发现近20种人BMP。BMP属于TGF-β超家族成员，不仅在骨骼的发育和再生修复中发挥关键作用，而且在中胚层的诱导和分化、造血组织的形成和发育、神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用。因而对BMP的研究不仅有重要的理论意义，而且还具有广阔的临床应用前景。从骨组织提取BMP，方法烦琐、收获量少、纯度低、重复性差，因此，用基因工程制备BMP就成为将BMP推向应用的必然途径。国内外在COS、CHO、昆虫等真核细胞中已经表达得到不同种人BMP，但表达量低，成本昂贵；我研究组率先在大肠杆菌中高表达获得具诱骨活性的人BMP-2和-3羧基端肽，为BMP的研究和应用提供了新来源。 然而BMP的研究和应用遇到了一大难题——至今还没有理想的定量测定BMP生物学活性的方法，这大大限制了BMP临床应用的进度。目前国内外对BMP的测活，基本上还是沿用Urist最早采用的体内植入法，即将BMP 第 四 军 医 大 学 博 土 论 义 植入动物骨以外的组织（最常用是肌肉）中，植入后不同时间作组织学切片、 X－线照像等检查，以观察其有无诱导骨组织生成的活性。该方法能从整体观 察BMP的真实活性，但实验周期长（一般要2－3周）、只能定性而不能定量， 而且结果受动物品种、植入状况等因素影响，仅看BMP有无活性，难以比 较不同来源、不同批次等BMP的活性，这使BW的研究工作和生产应用缺 乏量的依据。为此国内外在BW定量测活研究上作过很多努力，包括在整 体植人法（常用植入肌肉中的方法称为肌袋实验）的基础上发展的方法。近 年来又发展了一些体外测活方法，如测定BMP刺激后培养细胞的ALP活性、 蛋白聚糖水平、钙盐沉积的量和速度等。但进展都不大，BMP的定量测活 仍未解决。 BMP定量测活困难的原因在于它是个分化因子。一般促进细胞生长繁 殖的生长因于可以用同位素前体参入DNA来观察促生长的效应，从而定义 其活性的单位。而BMP与这些细胞生长因子不同，它的活性表现在使细胞 分化上，促进细胞生长不是BMP活性的主要表现，有时反而抑制细胞繁殖； 故不能用DNA合成和细胞分裂繁殖的速度来衡量其活性。而且BMP促细胞 分化的表现又是多方面的，因此造成定量测活的困难。不过，因BMP最初 是作为诱骨分于被发现，所以其活性检测基本还是围绕BMP这一基本特性， 即促成骨分化来进行。 为此我们也从BMP分化功能的角度探讨了BMP的定量测活，包括测定 BMP刺激后ALP活性、合成蛋白量等的变化，除骨髓细胞外，其余细胞系 nP活性并无明显变化。另外我们还用放免法测定了BMP－2作用不同细胞 后骨钙素（OC）的含量变化，该指标虽然特异，但反应幅度不够大，最大 增加约1倍多，且该方法要用同位素，检测步骤烦琐。所以说BMP的研究， 特别是重组人BMP的研究和临床应用，迫切需要建立一种可快速定量的活 性测定方法。 近年克隆发现的Cbfal是成骨分化特异性转录因子，对成骨分化发挥极 其关键的转录激活作用，Cbfal的基因敲除或突变将导致全身骨骼发育障碍。 Cbfal 在非成骨细胞或成骨前体细胞均可上调成骨分化相关基因——一骨钙 一 第 四 军 医 大 学 博 士 论 文 素、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALPL骨桥素及 1型胶原基因的表达， 而且证实这些基因的启动子内均有与 Cbfa 结合的作用元件。研究发现， 某些正常情况下并无成骨细胞表型的细胞（如间充质细胞C3H10TI／2等）， 在BMP诱导其成骨分化过程中，首先出现Cbfal 的高表达，然后出现碱性 磷酸酶（ALP）、骨钙素（OC）、骨桥素的表达。这说明Cbfal是BMP作用 信号的下游靶分子，BMP诱导成骨分化是通过Cbfal的中介完成，即Cbfal 接到BMP刺激信号后，结合到成骨分化相关基因启动子内的Cbfal作用元 件，从而启动、激活这些基因的转录、表达。 这些研究结果使我们产生定量测定BMP活性的新思路。因骨钙素是成骨 分化特异性相关标志，所以我们选定骨钙素作为BMP诱骨分化的靶向指标。 而荧光素酶报告基因系统是近年发展起来、广泛应用的基因转录报告系统， 它是通过上游启动子启动Luciferase基因表达，然后检测荧光素酶分解底物产