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目的通过两种止血方法建立5/6肾切除大鼠尿毒症动物模型,对比两种止血方法在大鼠尿毒症模型的应用。利用LPS刺激尿毒症大鼠模型腹膜纤维化,通过分子水平的研究探讨苦参碱对腹膜纤维化的作用。方法(1)清洁级别雄性SD大鼠分随机为A、B两组,均采用左肾2/3切除加右肾切除制作尿毒症模型。A组左肾2/3切除时采用3M组织胶止血,B组采用电凝止血,术中比较出血量、左肾血流阻断时间,术后对比大鼠的存活率,测肌酐值,以达到正常血肌酐值23倍者为尿毒症大鼠模型。肾脏组织行HE染色及Masson染色。(2)根据实验(1)中3M组织胶止血方法确定的尿毒症大鼠模型,5/6肾二次切除术后3月的尿毒症大鼠共30只,异氟烷麻醉后留置腹膜透析导管。置管成功后随机分为5组,每组6只,分别经腹膜透析导管腹腔注射生理盐水2ml+腹膜透析液(100ml/Kg)、LPS(2mg/Kg,共2ml)+腹膜透析液(100ml/Kg)+苦参碱(12.5 mg/Kg)、LPS(2mg/Kg,共2ml)+腹膜透析液(100ml/Kg)+苦参碱(25 mg/Kg)、LPS(2mg/Kg,共2ml)+腹膜透析液(100ml/Kg)+苦参碱(50 mg/Kg),1次/隔日×7次。结束腹膜透析7天后行腹膜平衡实验评估腹膜功能,二氧化碳法处死大鼠,留取腹膜组织,行Masson染色,免疫组化染色检测COL I,分析各组腹膜组织的纤维化情况。荧光定量PCR和(或)蛋白质印迹法检测α-SMA、Vimentin、COL I、TGF-β1、E-cadherin和Smad3水平。结果(1)两种止血方法的血肌酐均升高达尿毒症模型要求;A组左肾血流阻断时间为(59.97±7.56)s,B组为(174.1±15.28)s(P<0.05);A组左肾切除的出血量为(0.11±0.037)mL,B组为(0.24±0.056)mL(P<0.05);两组肾组织病理学检测均提示肾小球缺血皱缩、小管间质纤维化;A组的术后存活率明显高于B组(P<0.05)。(2)病理学提示生理盐水对照组腹膜平均厚度为24.38±5.91μm,LPS刺激组腹膜平均厚度为199.48±23.40μm,苦参碱12.5mg/Kg组腹膜平均厚度为48.41±5.21μm,苦参碱25mg/Kg组腹膜平均厚度为42.40±5.83μm,苦参碱50mg/Kg组腹膜平均厚度为81.62±7.14μm。LPS刺激组的腹膜组织明显增厚,与生理盐水对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义。苦参碱12.5mg/Kg组、25mg/Kg、50mg/Kg组与LPS刺激组比较,P<0.05,差异有统计学意义。(2)生理盐水刺激组的腹膜间皮细胞呈扁平状、连续性。LPS刺激组腹膜间皮细胞呈圆柱状或椭圆状、部分脱落。苦参碱干预组的腹膜损伤均轻于LPS组。腹膜平衡实验提示生理盐水对照组D/Purea为0.67±0.68,D/PCr为0.66±0.07,为高平均转运型。LPS刺激组D/Purea为1.07±0.11,D/PCr为1.0±0.09,为高转运型,与生理盐水对照组比较,差异有统计学意义。苦参碱12.5mg/Kg组D/Purea为0.92±0.10,D/PCr为0.84±0.10,为高转运型,与生理盐水对照组及LPS刺激组比较,差异均有统计学意义。苦参碱25mg/Kg组为D/Purea为0.78±0.13,D/PCr为0.75±0.07,为高平均转运型,与LPS组比较,差异有统计学意义;与生理盐水对照组比较,差异无统计学意义。苦参碱50mg/Kg组D/Purea为1.00±0.61,D/PCr为1.01±0.05,为高转运型,与生理盐水对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义,但是与LPS刺激组比较,差异无统计学意义。荧光定量PCR提示TGF-β1、Smad3、α-SMA和COL I的mRNA在生理盐水对照组表达量低,LPS刺激后,其表达量明显升高,与生理盐水对照组比较,P<0.05,差异均有统计学意义。苦参碱组表达量均较LPS刺激组下降,P<0.05,差异均有统计学意义。E-cadherin在LPS刺激后下降,苦参碱干预后其RNA表达量升高,在苦参碱25mg/Kg时升高最明显,而当苦参碱浓度达50mg/Kg时,其表达量与LPS刺激组几乎相当。Vimentin在生理盐水对照组的表达量低,在LPS刺激后其表达量升高,但是差异无统计学意义。蛋白印迹结果表明α-SMA在用LPS刺激后升高,与生理盐水对照组比较,P<0.05,差异有统计学意义。用苦参碱干预后,其蛋白表达量下降,与LPS刺激组比较,P<0.05,差异有统计学意义;与生理盐水对照组比较,只有苦参碱25mg/Kg组差异有统计学意义(P=0.039)。TGF-β1的蛋白水平在LPS刺激后也明显升高,用苦参碱干预后,其蛋白表达水平下降。Vimentin的蛋白表达量在LPS刺激后也明显升高,与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但是在苦参碱干预后,其表达量并无明显下降,与LPS刺激组计较,差异无统计学意义。结论1.5/6肾切除术中3M组织胶止血和电凝止血均可以成功制作慢性肾功能不全尿毒症动物模型,但是3M组织胶止血法在制作尿毒症大鼠模型时,无论是出血时间、出血量,还是术后存活率均优于电凝止血法。2.腹腔注射LPS可以诱导尿毒症大鼠腹膜纤维化,其纤维化发生可能与间充质转化相关。3.一定浓度的苦参碱可以改善LPS诱导的腹膜纤维化,TGF-β1/Smad3可能在其中发挥重要作用。