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目的：本研究通过细胞体外诱导培养方法,观察姜黄素对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)生成破骨细胞数量、活力,和转录因子c-Fos、NFATcl的表达及MAPKs信号通路ERK1/2、p38和JNK磷酸化的影响。进一步在TNF-α、RNAKL、M-CSF等细胞因子不同诱导条件下培养健康志愿者及RA患者PBMC,并予姜黄素干预,观察炎性因子TNF-α对PBMC破骨细胞生成的影响,以及姜黄素在炎性条件下对PBMC破骨细胞生成及细胞RANK蛋白及mRNA的影响。探讨姜黄素对RA患者破骨细胞生成、活化的影响及其可能的机制,为临床应用姜黄素提供新的实验室依据,也为活血化瘀中药治疗RA提供新思路。方法：1、(1)采集RA患者外周血,密度梯度离心法获得PBMC,贴壁法纯化。用含细胞因子RANKL (100 nmol/L), M-CSF (50 nmol/L)和20%胎牛血清的α-MEM培养基诱导法培养,隔天换液。分别于14天、21天后通过细胞形态学特征、TRAP染色及骨吸收陷窝鉴定所得细胞。(2)CCK-8检测不同浓度姜黄素溶液对PBMC的毒性,确定实验用姜黄素溶液的浓度。(3)设空白对照组,姜黄素低浓度组(2.5μmol/L),姜黄素中浓度组(5μmol/L)和姜黄素高浓度组(10μmol/L),每组3复孔。诱导培养RA患者PBMC,按分组给予姜黄素干预。14天后行TRAP染色并计数；检测细胞酸性磷酸酶活性；ELISA法检测培养上清液中CatK、MMP-9含量；Western-blot检测破骨细胞c-Fos、NFATcl和ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK蛋白的表达；计算MAPKs磷酸化率。2、(1)采集健康志愿者及RA患者PBMC诱导培养。根据PBMC来源及诱导液组成的不同分为NO(健康,R+M),N1(健康,2.5ng/ml TNF-α+M),N2[健康,5ng/ml TNF-α+M),N3(健康,10ng/ml TNF-α+M), N4i[健康,5ng/ml TNF-α+R+M), R0(RA, R+M), R1(RA, 2.5 ng/ml TNF-α+M), R2(RA,5ng/ml TNF-α+M), R3(RA, 10ng/ml TNF-α+M), R4(RA, 5ng/ml TNF-α+R+M)共8组,每组3复孔。14天后行TRAP染色鉴定及细胞计数。(2)设空白对照组,TNF-α低浓度组(2.5ng/ml)、TNF-α中浓度组(5ng/ml)和TNF-α高浓度组(10ng/ml)。分别与RANKL (100 nmol/L)+M-CSF (50 nmol/L)联合诱导培养RA患者PBMC。14天后行TRAP染色并计数；Western-blot法检测细胞RNAK、TRAP6蛋白表达。(3)设空白对照组,姜黄素低浓度组(2.5μmol/L),姜黄素中浓度组(5μmol/L)和姜黄素高浓度组(10μmol/L),用含TNF-α (5ng/ml)、RANKL (100 nmol/L、M-CSF (50 nmol/L)和20%胎牛血清的α-MEM培养基联合诱导培养RA患者PBMC,并按分组给予不同浓度姜黄素干预。14天后行TRAP染色计数,RT-PCR法、Western-blot法检测细胞RANK mRNA及蛋白的表达。结果1(1)培养14天后,光镜下细胞形态特征、TRAP染色及骨吸收陷窝结果鉴定本实验方法诱导RA患者PBMC获得的细胞符合破骨细胞特点。(2)CCK-8结果显示姜黄素浓度2.5,5,10μmol/L组在24h,48h,72h的细胞活力与不含姜黄素组无明显差异；姜黄素浓度20、40μmol/组24h,48h,72h细胞活力均显著下降(p<0.05),因此认为20μmol/L以上姜黄素溶液具有细胞毒性。故将姜黄素干预浓度分别设为2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L。(3)RA患者PBMC加入不同浓度姜黄素溶液培养14天后,姜黄素低浓度组、姜黄素中浓度组和姜黄素高浓度组TRAP染色细胞计数(个/10个视野)分别为96.89±3.5 1、76.44±1.88和62.56±2.70,低于空白对照组131.00±±4.03(p<0.05)；各浓度组的酸性磷酸酶活性(U/L)分别为5.74±0.36、4.21±0.12和3.064±0.07均低于空白对照组7.484±0.22(p<0.05)。各组ELISA法检测的细胞培养上清液中CatK、MMP-9含量也均低于空白对照组(p<0.05)。(4)Western-blot检测结果,低、中、高浓度姜黄素组c-Fos蛋白分别为0.354±0.077、0.273±0.022和0.176±±0.025均低于空白对照组1.073±0.073(p<0.05)；NFATcl蛋白分别为0.352±0.059、0.387±±0.075和0.245±0.020也低于空白对照组1.133±0.066(p<0.05)。Western-blot检测破骨细胞ERK1/2μp-ERK1/2、p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白,并计算磷酸化率。结果显示,姜黄素低浓度组、姜黄素中浓度组和姜黄素高浓度组ERK1/2的磷酸化率(%)为0.510±0.062、0.400±0.003和0.281±0.020低于空白对照组0.758±0.016；p-38磷酸化率(%)分别为0.512±±0.008、0.464±0.063和0.382±±0.032低于空白对照组0.759±0.054；JNK磷酸化率(%)分别为0.434±0.010、0.396±0.004和0.316±0.027低于空白对照组0.734±0.032。且差异均有统计学意义(p<0.05)。2(1)培养14天后,TRAP染色结果显示,N1、N2、N3和R1、R2、R3组的细胞TRAP染色后胞质仅有少许紫红色淡染,细胞小,形态以圆形或椭圆形为主,仍为单核,不具有典型破骨细胞特征。(2)N0、N4、R0、R4细胞TRAP染色阳性。细胞计数(个/10个视野)R0组为117.56±8.96高于NO组100.11±7.46,R4组为124.78±11.72高于NO组114.33±10.05,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)不同浓度TNF-a和RANKL+M-CSF联合诱导RA患者外周血PBMC 14天后,TRAP染色阳性细胞计数、Western-blot检测RANK和TRAP6蛋白结果显示TNF-a低、中、高浓均高于不加TNF-a的空白对照组的,且促进作用都随TNF-a浓度升高而升高,各指标各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)姜黄素干预TNF-a+RNAKL+M-CSF联合诱导的RA患者PBMC14天后,结果显示能姜黄素能降低TRAP染色阳性细胞数及RNAK mRNA和蛋白量,且抑制作用随浓度增高呈增强趋势(P<0.05)。结论本研究通过观察姜黄素对体外诱导培养RA患者外周血单个核细胞(PBMC)生成破骨细胞数量、活性及相关信号通路的影响,得出以下初步结论：1、姜黄素具有抑制RA患者PBMC破骨细胞生成数量和表达TRAP、组织蛋白酶K、MMP-9的细胞活性作用,其机制可能与通过降低p-ERK1/2、p-p38、p-JNK蛋白,由此降低其磷酸化率,从而抑制c-Fos和NFATcl表达有关。这提示姜黄素可以通过磷酸化MAPKs通路,在抑制破骨细胞生成和活化中起重要作用。2、RA患者PBMC破骨细胞生成能力大于健康人。3、TNF-a在没有RANKL的条件下不能诱导PBMC生成破骨细胞,但是能增加RANKL诱导PBMC破骨细胞生成数量及其细胞RANK、TRAP6蛋白表达,这可能是炎性细胞因子TNF-α促进破骨细胞生成,加强骨破坏的重要作用机制。4、姜黄素能降低TNF-α+RANKL+M-CSF联合诱导PBMC破骨细胞生成数量及RANK蛋白和mRNA,其机制有待进一步探讨。