论文部分内容阅读
高等植物几丁质酶(Chitinase)在抗病、抗冻及逆境胁迫等方面具有重要作用,但在低温胁迫下它才表现抗病和抗冻双重活性,非低温胁迫下仅具有抗病活性;转抗冻蛋白(AFP)基因的高等植物能在一定程度上改变耐寒性,但转入单基因易丢失,持续抗寒能力不理想,因而植物抗寒研究转向调控抗寒基因表达效率方面。冷诱导调控因子CBFs家族,广泛作用于高等植物的低温调控中,Ubiquitin启动子在单子叶植物中具有较强的基因表达调控能力。本研究利用RT-PCR、基因定位、Western杂交、遗传转化体系构建、农杆菌介导、PCR-Southern杂交等技术,根据GenBank已发表的EAPP基因序列设计特异性引物,克隆冬牧70黑麦(Secale cereale cv Dongmu-70) EAPP基因,分析该基因编码的蛋白功能,探索基因亚细胞定位及低温胁迫对基因表达规律的影响;通过构建Ubi1::CBF3植物表达载体,将其导入单、双子叶牧草中,探讨CBF3冷诱导调控因子提高牧草抗寒性的可行性。获得以下主要结果:1)冬牧70黑麦EAPP基因cDNA全长序列为1085bp,与禾本科中大麦和小麦同源性极高,分别为95%和91%;2)EAPP基因编码的蛋白相对分子量为33.6KD,含有糖苷水解酶家族19几丁质酶结构域和几丁质结合区结构域,在1-20AA存在信号肽,等电点PI=7.38,是一种mixed型分泌蛋白;3)洋葱表皮细胞定位及原生质体转化研究确定,冬牧70黑麦EAPP基因表达的蛋白定位于细胞膜上;4)冬牧70黑麦的EAPP基因常温下在根茎叶中均有表达,但叶中表达量最高,4℃低温胁迫下其表达水平在根茎叶中都大为提高,24h时表达量达到最大值,其后略有下降;5)成功获得CBF3转基因单子叶(剪股颖,禾本科)及双子叶(红三叶,豆科)牧草的阳性植株,经鉴定CBF3基因已成功整合到剪股颖及红三叶染色体组中;6)Ubi1::CBF3基因超表达对剪股颖转基因苗早期生长的影响较大,一定比例植株出现轻微生长延滞的现象,而对红三叶转基因苗早期生长影响较轻,转基因植株生长较正常;7)CBF3基因过量表达导致转基因牧草中脯氨酸含量、叶片净光合速率和蒸腾速率有较大提高,其中在正常条件下,剪股颖转基因植株比对照分别提高了61.64%、68.85%及46.13%,红三叶转基因植株则相应提高了29.99%、23.56%及18.57%,而剪股颖和红三叶转基因苗叶片MDA含量分别比野生型下降了41.46%和31.29%(P<0.05);8)4℃低温胁迫下,剪股颖及红三叶转基因植株的脯氨酸含量、叶片净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度以及气孔导度虽然出现下降趋势,但仍显著高于野生型,MDA含量亦低于野生型在低温胁迫下的表现,表明Ubi1::CBF3在单子叶及双子叶牧草中超表达可显著提高两种牧草抗寒能力,但两种转基因植物的早期生长、抗寒性及光合特性均存在显著差异,Ubi1::CBF3在单子叶牧草中的作用显著强于双子叶牧草。总之,对牧草重要抗寒基因EAPP的克隆和遗传分析,有助于了解其抗寒机制,而重要转录因子CBF3在牧草中导入及其功能分析则更进一步开拓了转基因牧草深入应用的可行性。