研究背景：骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种全身骨量减少。骨组织显微结构破坏致使骨脆性增加从而易骨折的疾病,被称之为“隐形杀手”。它与年龄、性别、饮酒、雌激素缺乏、长期使用糖皮质激素等多种因素有关。随着世界人口老龄化的趋势越来越明显,OP已成为未来医疗和社会的重大问题。许多消化系统疾病如胃切除术、慢性肝病、炎症性肠病等有较高的骨质疏松发生率,但目前对这些疾病引起骨质疏松的机理尚不明确在对胃切除术后骨病的多年研究中,有学者提出在胃内对骨代谢其主要作用的物质存在于胃底泌酸粘膜中的肠嗜铬样细胞(enterochromaffin-like cell, ECL cell)中,胃泌素可以通过刺激这种激素的分泌来间接发挥降低血钙浓度和刺激钙吸收入骨的作用钙是重要的骨矿物质元素,骨钙盐不仅具有结构功能,还具有代谢作用,在机体需要时从骨中释放入血维持细胞和体液中钙浓度的稳定。钙的减少和丢失是引起骨密度下降进而导致骨质疏松的重要因素之一。在脊椎动物中,小肠对饮食中钙的吸收是机体获得钙的主要途径,小肠钙吸收对骨骼生长和代谢发挥了重要作用。研究发现小肠粘膜病变或切除小肠后可导致骨密度下降,骨质疏松发病率增加。近端小肠(十二指肠和近端空肠)是钙吸收的主要部位,体内外研究均证实小肠上皮钙吸收受多种激素如活性维生素D3(1alpha-dihydroxycholecalciferol,1,25(OH)2D3),雌激素,糖皮质激素,甲状旁腺激素(PTH)的调控。小肠上皮钙吸收过程极极其复杂,通常认为跨细胞转运(主动转运)途径是近端小肠钙吸收的主要方式。多种转运蛋白在跨细胞转运中发挥了重要的作用,例如小肠粘膜侧膜上钙通道瞬时受体电位香草酸亚型6(transient receptor potential vanilloid member6, TRPV6)和电压依赖性钙通道(voltage-dependent L-type calcium channel, Cavl.3)的开放使钙进入细胞内,与胞浆内的钙结合蛋白(calcium-binding protein, Calbindin-D9k, Cabp)结合运输至基底侧,然后通过浆膜侧钠钙交换器(sodium calcium exchangerl, NCX1)和质膜钙ATP酶(plasma membrane calcium ATPase1, PMCA1)出胞进入血循环。目前研究认为这些激素可通过影响上述转运蛋白的一种或多种来对钙吸收进行调控。如泌乳素通过磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)／蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)信号通路调节Cavl.3和PMCA1的表达来影响小肠上皮细胞钙的吸收和转运。PTHrP基因结构非常复杂,有九个外显子,通过选择性剪切和翻译后修饰主要产生N端(1-36),中间区域(87-106,核定位信号,NLS)及C端(107-139)三个活性肽段,这三种肽段可与独自受体结合参与多种生理过程。研究表明PTHrP可影响骨、肾、乳腺、胎盘等多种组织中的钙吸收,但其作用受体、作用肽段却不同。例如PTHrP (1-34)与受体PTHR1结合通过PKA和PKC两条信号传导通路促进成骨细胞钙吸收的增加,而在调节胎盘滋养层细胞的单向钙离子转运中,发挥作用的肽段则是67-86,且其结合受体亦不同于PTHR1。在硬骨鱼的小肠上皮中则检测到PTHrP的一种新受体PTHR3的存在。以上研究结果显示在不同种属、不同组织中PTHrP可能与不同受体结合来调节钙离子的转运。PTHrP在哺乳动物小肠上皮细胞所结合的受体有待于进一步研究。细胞膜相关性快反应类固醇结合蛋白(membrane-associated, rapid response, steroid binding,1,25D3-MARRS)/PDIA3/ERp57是蛋白质二硫化物异构酶家族中的一员,是人类进化中较为保守的蛋白,可在小肠、肾、脑、骨等多种组织中表达,参与糖基化、离子迁移、能量代谢甚至基因转录等多个生理过程。近年研究发现1,25(OH)2D3除与核受体VDR结合外,还可与小肠上皮细胞膜受体1,25D3-MARRS蛋白结合,通过PKA和PKC两条信号通路参与钙、磷的迅速吸收和转运。由于其亲本蛋白PDI能够与雌激素和甲状旁腺激素等激素结合,有学者推测1,25D3-MARRS蛋白是多种激素的选择性受体。根据上述研究结果我们推测,小肠上皮细胞膜受体1,25D3-MARRS蛋白可能是PTHrP的作用受体之一,PTHrP可与1,25D3-MARRS蛋白结合促进小肠上皮的钙吸收。根据国内外研究现状以及本课题组前期研究结果,我们提出以下假设：PTHrP可能就是胃粘膜ECL细胞中维持骨钙代谢的重要激素。PTHrP可能通过旁分泌或自分泌途径作用到小肠上皮细胞,与膜受体1.25D3-MARRS蛋白结合,激活PKA和PKC等信号通路,调节Cav1.3/TRPV6等钙转运蛋白的表达,引起钙离子的迅速吸收和转运,进而维持机体钙平衡和骨钙代谢。这一假说如能证实,不仅能进一步明确小肠上皮细胞对钙吸收和转运的作用途径,加深对PTHrP性质和功能的认识,还有助于阐明胃肠道疾病诱发OP的病理机制,为OP的防治提供新的途径。研究目的研究目标(1)明确PTHrP对小肠上皮细胞钙吸收的作用受体及信号传导途径。(2)进一步阐明胃切除术后等消化道疾病诱发骨质疏松症的病理机制。研究方法1胃粘膜PTHrP的检测以及胃泌素干预后对PTHrP表达水平的影响收集人胃正常粘膜,行RT-PCR方法从mRNA水平检测PTHLH在人胃粘膜的表达,通过免疫组织化学方法对PTHrP在胃粘膜的分布进行定位研究。建立胃泌素干预大鼠模型,通过RT-PCR和免疫组织化学方法来观察胃泌素刺激对PTHLH/PTHrP表达水平的影响。2大鼠肠上皮细胞的培养大鼠肠上皮细胞(IEC-6)来自本实验室收藏。细胞复苏后在37℃、5%C02条件下用含8%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,待细胞生长至80%融合时用于各种实验。3钙离子吸收的检测IEC-6细胞计数后浓度调整至1×104/mL,均匀接种于激光共聚焦显微镜专用的35mmm2培养皿中,细胞密度达到50%左右时换为无血清培养基饥饿过夜,次日用PBS洗涤两遍后,进行细胞内钙离子探针fluo-4am的荧光装载。在激光共聚焦显微镜下观察施加刺激因素前后胞内荧光强度的变化,获得反应细胞内钙离子浓度动态变化的曲线。如观察不同抑制剂对钙离子吸收的影响,则在装载完探针后,先在培养皿中加入不同的抑制剂孵育指定的时间,然后再在共聚焦显微镜下加入刺激剂,观察并记录细胞内荧光强度的变化。4PTHrP影响小肠上皮钙吸收的作用片段在共聚焦培养皿中,分别加入6nM的PTHrP(1-40)、(67-86)、(134-173)三种作用肽段,观察不同片段的PTHrP对钙离子吸收的影响；培养板的细胞中分别加入不同片段的PTHrP,6小时后收集细胞分别提取RNA和蛋白,通过RT-PCR和western-blot实验检测观察不同片段的PTHrP对钙通道蛋白的影响。5PTHrP(1-40)影响钙离子吸收的浓度效应和时间效应关系分别观察不同浓度(0.1nm,1nm,3nm,6nm,10nm)下PTHrP对小肠上皮细胞钙吸收和相关钙通道蛋白的剂量-效应关系,和不同时间(0,3h,6h,9h,12h,24h)PTHrP对小肠上皮细胞中钙通道蛋白的影响。6PTHrP作用受体的研究通过RT-PCR和western-blot方法检测PTHrP刺激IEC-6细胞后PTHR1, PTHR2,以及1,25D3-MARRS等几种受体基因和蛋白水平的变化。用抗体封闭方法观察阻断受体后PTHrP对IEC-6细胞中钙吸收的影响。7钙通道蛋白在PTHrP影响钙吸收中的所发挥的作用用钙通道阻断剂或过饱和抗体封闭来封闭各种转运蛋白的表达,结合瞬时转染沉默相关钙通道蛋白基因的表达,观察干扰前后PTHrP对IEC-6细胞中钙吸收的影响。8PTHrP对PKA、PKC信号通路的影响选取不同时间点(0, lm,3m,5m,7m,10m,15m,20m,30m,60m,90m,120m), PTHrP刺激IEC-6细胞后PKA, PKC蛋白水平的变化。9PKA、PKC信号通路在PTHrP影响IEC-6细胞中钙吸收的作用观察PKA、PKC抑制剂作用在IEC-6细胞中预孵育30分钟,再加入刺激PTHrP,观察钙离子吸收的变化。结果1PTHLH/PTHrP在人和大鼠的正常胃粘膜中具有表达,胃泌素干预后PTHrP的mRNA水平表达显著性增加,有统计学差异(P<0.001)。2在小肠上皮细胞中,PTHrP是通过片段1-40而不是67-86或134-173来发挥作用的。(1)在共聚焦显微镜下,分别加入6nm的不同活性片段的PTHrP,结果显示仅有1-40能够引起胞内钙离子的显著增加(与对照组相比,P<0.05),而另两个片段67-86或134-173刺激组钙离子吸收的变化无显著性差异(P>0.05)。(2)通过RT-PCR和western-blot试验也发现仅有片段1-40能够引起钙通道相关蛋白(主要为TRPV6, Cabp, PMC A, NCX)的基因和蛋白水平的表达升高(P<0.05),而片段67-86,和134-173刺激组对钙通道蛋白的mRNA和蛋白的影响无统计学差异。3PTHrP(1-40)在低剂量6nM下即可引起小肠上皮细胞钙离子的迅速吸收,而类似物PTH的作用浓度则是100nM(与PTHrP组相比,P<0.05)。PTHrP在短时间内即可引起钙通道相关蛋白基因和蛋白水平的变化,在6小时内即可引起钙通道蛋白的显著升高(P<0.05)。4PTHrP可能不是通过L-型钙通道来引起钙吸收的。PTHrP不引起L-型钙通道蛋白cavl.3的表达增加(P>0.05),而L钙通道阻滞剂尼群地平也不能阻断PTHrP引起的钙离子吸收增加,加入PTHrP刺激前后钙荧光强度的变化有统计学差异(t=-10.364,P<0.001)。5在小肠上皮细胞中PTHrP可能是通过PTHR1受体来发挥作用的,在大鼠小肠上皮细胞中通过RT-PCR和western-blot试验未检测到PTHR2受体的表达。加入PTHR1抗体封闭后能够阻断PTHrP引起的钙离子吸收(P>0.05),而PTHR2受体封闭后则不能阻断该作用,刺激前后钙离子荧光强度的变化具有统计学差异(t=-4.760,P<0.001)。另外我们从基因和蛋白水平检测到PTHrP不能引起1,25D3-MARRS受体水平的变化,而用1,25D3-MARRS抗体封闭后也不能阻止PTHrP引起的钙离子吸收的增加(t=-90.077,P<0.001)。6钙通道蛋白TRPV6, Cabp可以阻断PTHrP引起的钙离子吸收,PTHrP刺激前后钙离子荧光强度变化无统计学差异(P>0.05),而PMCA和NCX则无此作用,加入PMCA和NCX的阻断剂或抗体封闭后,PTHrP(1-40)仍可以促进钙离子的迅速吸收(P<0.05)。7PTHrP可能是通过PKC而不是PKA信号通路来引起钙吸收的。PKA抑制剂H-89不能阻断PTHrP引起的钙离子吸收,刺激前后变化有统计学差异(t=-7.472,P<0.001),而PKC抑制剂GO1918可以阻断钙离子的吸收(P>0.05)。结论：1PTHrP在人和大鼠的正常胃粘膜的ECL细胞中表达,胃泌素刺激可以增加胃粘膜内PTHrP的表达,提示PTHrP可能是消化道内促进钙吸收入骨和维持正常骨量的重要激素。2PTHrP可以促进大鼠小肠上皮细胞的钙离子吸收和钙转运相关蛋白的表达增加,主要是通过片段1-40来发挥作用的。3PTHrP(1-40)对大鼠小肠上皮细胞的钙吸收和钙通道蛋白的影响作用迅速(6小时),作用剂量低,PTHrP(1-40)主要可以引起跨细胞通路钙通道相关蛋白(TRPV6, Cabp, PMCA, NCX)的基因和蛋白水平表达增加,提示PTHrP在大鼠小肠上皮细胞的钙转运机制中主要影响的是跨细胞主动转运通路。4PTHrP(1-40)可能不是通过L-型钙通路来影响小肠上皮细胞钙吸收的。5钙通道蛋白TRPV6, Cabp可以阻断PTHrP(1-40)引起的钙离子吸收,可做为治疗干预的靶点,而PMCA和NCX并不能阻断PTHrP(1-40)引起的钙吸收增加,PMCA和NCX是否在PTHrP引起钙转运中的发挥作用将有待于进一步的研究。6PTHrP(1-40)在大鼠小肠上皮细胞上的作用受体可能是PTHR1而不是PTHR2, PTHR1而非PTHR2可以阻断PTHrP(1-40)引起的胞浆内钙离子的吸收,1,25D3-MARRS受体可能不是PTHrP(1-40)作用在IEC-6细胞上的受体,1,25D3-MARRS不能阻止PTHrP(1-40)引起的钙离子吸收增加。7PTHrP引起的钙吸收增加可能是通过PKC信号通路来完成的,其激活的下游信号通路将有待于进一步研究。