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肺癌是目前全球致死率最高的恶性肿瘤。在我国,肺癌也是近几十年发病率和死亡率上升速度最快的恶性肿瘤。非小细胞肺癌大约占肺癌的80-85%,而一经发现,多处于晚期,失去了手术时机。靶向药物的发现为非小细胞肺癌的治疗带来了曙光。对于表皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌患者,吉非替尼的缓解率为70%-80%,明显高于传统的化疗。但是,吉非替尼继发耐药的产生导致药物的失效。肝细胞生长因子(HGF)的过表达是一种重要的继发耐药机制。因此,寻求有效的方案解决HGF诱发的吉非替尼继发耐药问题具有重要的临床意义。第一部分克唑替尼克服由HGF介导的EGFR突变非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的耐药目的：肝细胞生长因子(HGF)的过表达是表皮生长因子受体(EGFR)突变非小细胞肺癌(NSCLC)对吉非替尼(Gefitinib)继发耐药的重要机制。本研究探讨克唑替尼(Crizotinib),一种有效的肝细胞生长因子受体(MET)酪氨酸激酶抑制剂,能否逆转HGF诱发的EGFR突变NCSLC细胞对Gefitinib的继发耐药。方法：本研究采用HCC827和PC-9两种EGFR突变的NSCLC细胞株。在细胞培养基中加入重组人HGF蛋白,建立细胞继发耐药模型。以CCK-8和流式细胞凋亡检测分别分析联合应用(Czotinib和Gefitinib对耐药细胞增殖活性与凋亡能力的影响。应用Western Blot方法进行HGF/MET信号通路蛋白的检测,探讨分子机制。结果：HCC827和PC-9细胞对Gefitinib高度敏感,而在外源性HGF的暴露下,细胞对Gefitinib的敏感性显著下降。联合应用Crizotinib,可以显著抑制耐药细胞的增殖,其抑制率呈现浓度依赖性。同时,Gefitinib联合应用Crizotinib,可以使HCC827耐药细胞的凋亡率增加19.8%。蛋白检测提示HGF诱导的继发耐药是通过激活MET蛋白,绕过受抑制的EGFR通路,旁路激活下游的信号通路。联合应用Crizotinib可有效的阻断MET蛋白的激活,从而抑制下游通路的活化。此外,联合应用Crizotinib可以抑制因HGF的短期处理而产生的稳定的配体非依赖性HCC827耐药细胞的产生。结论：Crizotinib能有效的逆转HGF诱发的EGFR突变NSCLC细胞对Gefitinib的继发耐药,提示联合应用Crizotinib对治疗因HGF诱发的Geftinib继发耐药具有潜在的临床应用价值。第二部分MiR-34a克服HGF诱发的EGFR突变非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的继发耐药目的：MiR-34a是一种有效的抑癌小分子,外源性的过表达miR-34a可以促进多种恶性肿瘤细胞包括肺癌细胞的凋亡和抑制细胞的增殖、侵袭和迁移。同时,miR-34a对HGF/MET信号通路的蛋白有重要的调节作用,本研究探讨miR-34a能否通过抑制HGF/MET信号通路克服HGF诱导的EGFR突变非小细胞肺癌对Gefitinib的继发耐药。方法：应用HCC827和PC-9两种EGFR突变的非小细胞肺癌细胞株。外源性加入重组HGF蛋白,建立HGF诱导的Gefitinib继发耐药细胞模型。通过体外转染miR-34a mimics进行体外细胞的获得性功能实验。应用CCK-8、流式细胞凋亡检测来分析miR-34a的过表达对耐药细胞增殖和凋亡的影响。通过皮下注射混合的MRC-5(高表达HGF)和慢病毒感染的HCC827细胞建立裸鼠继发耐药模型,探讨联合IniR-34a的过表达和Gefitinib对耐药细胞成瘤能力的影响。应用WesternBlot方法进行HGF/MET信号通路蛋白的检测,探讨分子机制。利用荧光素酶报告系统对miR-34a对METmRNA的3’-UTR靶点作用进行鉴定。结果：在HGF的外源性处理下,HCC827和PC-9细胞对Gefitinib的敏感性显著下降,而Gefitinib联合miR-34a的过表达,可以显著抑制耐药细胞的增殖,其抑制性呈浓度依赖性,40nM miR-34a mimics处理耐药细胞,对HCC827的增殖抑制率比对照组增加28%,对PC-9的抑制率增加34%。同时,miR-34a的过表达,可以诱导耐药细胞的凋亡,使HCC827细胞的凋亡率增加14%。体内实验中,联合miR-34a过表达和Gefitinib对比空载体和Gefitinib的处理,可使移植瘤得到显著的缩退。蛋白检测提示miR-34a在耐药细胞中的过表达对MET的表达和下游Akt和ERK1/2途径的活化有显著的抑制作用。进一步荧光素酶报告系统分析证实MET是miR-34a的直接作用靶点。结论：本研究表明miR-34a可以逆转HGF诱发的EGFR突变非小细胞肺癌细胞对Gefitinib的继发耐药,提示miR.-34a在治疗肺癌继发耐药领域可能存在一定的潜力。