背景:在骨科和手外科的临床工作中,我们经常会遇到因外伤、肿瘤、感染、畸形等原因造成的骨缺损病例。对于骨缺损的治疗,临床应用较多的是自体骨移植和异体骨移植,也有应用金属假体或者人工骨进行填塞等。自体骨移植治疗骨缺损的疗效确切,骨愈合率高,是目前治疗骨缺损的金标准,但自体骨来源有限,而且给患者带来了供区的二次损伤,还有可能增加血肿、感染等风险。异体骨移植存在不同个体间的免疫排斥反应,而且,潜在的交叉感染也使人望而生畏。金属假体虽然机械强度大,但不可降解,在植入人体后,可能会有松动、过敏反应等不良后果。现在,开发具有一定强度,良好生物相容性和可降解性的生物材料,即人工骨,正越来越受人关注,而且,在组织工程学和再生医学方面都有很大的应用前景。目前认为,理想的生物材料修复骨缺损需要满足以下条件:(1)适当的抗压强度,起到骨支撑、骨介导作用(2)适当的降解率,与新生骨长入速率基本相持平(3)良好的生物相容性,无排斥和炎症反应等(4)良好的表面活性和孔隙率,利于骨细胞的吸附、增殖、长入和营养物质的转运等(5)具有一定的生物活性,可诱导骨形成,促进骨组织长入,加快骨缺损愈合。人体骨组织由无机盐和有机质构成,无机盐即矿物质,该类成分使骨骼坚硬,可影响硬度;有机质即骨胶原蛋白,使骨骼柔韧,可影响韧度。两者按一定比例结合,使骨在保持一定强度的情况下,拥有一定的韧度。近年来,仿生理组织成分的生物材料在组织工程中被广泛应用,用来制备骨支架的材料主要包括三大类,即无机盐类,天然有机高分子类和化学合成高分子类。无机材料包括羟基磷灰石(磷酸钙和氢氧化钙的复合物),磷酸钙骨水泥和生物活性玻璃(主要是由CaO,Na2O,P205和Si02等为基本成分所组成的硅酸盐类无机物)等,其中生物活性玻璃近年来的研究较多,因其成分与人类骨皮质成分相仿,且有良好的生物活性,可以很好地结合骨组织,利于长入。同时,生物活玻璃释放出的钙、硅等离子有骨诱导作用,可促进骨再生。但其脆性较大,可塑性低。天然高分子材料包括多糖类和蛋白类,无毒性,来源广泛,价格低廉,在体内降解性好,亲水性高,广泛应用于组织培养中,包括胶原蛋白,壳聚糖,植物蛋白(玉米醇溶蛋白,小麦醇溶蛋白等)等,但其物理性能差,力学强度低。化学合成的高分子材料,包括聚己内酯、聚乳酸等,力学性能好且稳定,免疫原性低,可控性好,但降解率低,而且在微环境内会产生酸性物质,可能导致炎症反应,不利于新骨长入等。由此可见,单一的材料很难满足理想生物材料的全部要求,而复合材料可互相弥补缺点,使得支架整体的抗压强度、降解性、生物相容性等不断得到改善,满足应用需要,目前也越来越受到青睐。介孔是直径介于微孔与大孔之间,2-50nm的孔隙。介孔材料制备时的模版为表面活性剂形成的超分子结构,然后通过溶胶-凝胶技术,材料颗粒根据有机和无机界面之间的定向作用,组装成一定孔径的无机多孔材料。一般生物大分子如蛋白质、核酸、酶等的分子量在1-100万之间时,直径小于1Onm,而分子量在1000万左右的病毒,其直径在30nm左右。介孔材料的孔径非常适合酶、蛋白质的固定与分离,在生物医药领域应用较多。制备生物材料支架的方法较多,包括溶剂浇铸-颗粒沥滤法、泡沫复制法、冷冻干燥法、气体泡沫法、层相分离法和静电纺丝法等。这些传统方法经济简便,但不能有效地控制支架的孔隙率、孔径大小和形态。3D打印技术是20世纪80年代兴起的一种新技术,它以计算机软件设计出的三维结构为模版,按照打印原理,以材料粉末(无机类、有机类)或单细胞为“墨汁”,通过激光束或热熔喷嘴等方式逐层打印,最终得到设计出的产品,包括支架、组织器官等等,在组织工程领域应用极广。目的:本研究利用3D打印技术,制备一种新型的复合介孔材料支架,可以人为的控制支架的孔隙率,孔径大小和孔道连通性,以希望利用组织工程学为骨缺损提供新的治疗方法。另外,我们改变支架中硅酸钙镁的含量,比较不同无机盐含量下的复合材料支架在体内和体外实验中的物理性能和生物性能,以期望揭示复合材料支架中,最佳的生物材料含量配比,在抗压强度、降解性、生物相容性、骨生长等方面得到最大程度的改善。方法:我们应用溶胶-凝胶法制备介孔硅酸钙镁纤维,以扫描电镜和透射电镜观察纤维内部孔道结构,根据BJH和BET法计算,N2吸附-解析等温线计算孔径分布。将制备的介孔生物玻璃硅酸钙镁(mMCS)纤维,和醇溶蛋白(GA),聚己内酯(PCL)混匀后,利用3D打印技术,制备了新的介孔材料支架(MGPC)。并且,我们改变支架中硅酸钙镁的含量,制备出三组不同支架,即GPC组(不含钙镁硅酸盐),15MGPC组(含15%钙镁硅酸盐)和30MGPC组(含30%钙镁硅酸盐),并通过体内和体外实验来比较不同支架的性能,从而揭示硅酸钙镁浓度对该支架性能的影响。在体外,我们通过力学测量仪对各支架组进行抗压强度测试,通过电镜观察支架内部结构,测量各支架的孔隙率;同时,将各支架组浸入Tris-HCl中,在不同时间点,通过扫描电镜观察支架表面形态,再用天平称量支架浸入前后质量的变化,来评估支架在体外的降解性;最后,我们将不同支架组放入培养皿中,与MC3T3-E1细胞共培养,在6小时,12小时和24小时后,通过扫描电镜观察细胞生长状态,测量细胞吸附率和增殖水平,观察细胞对支架的反应性,从而评估不同支架的生物相容性。在体内,我们将不同支架组植入兔股骨远端缺损模型中,在1个月,2个月,3个月时,取材,在大体标本下比较有无炎症反应及各支架的降解情况,经组织学切片,行H&E染色,观察和计算骨细胞长入情况和支架材料残余情况,再行Col I免疫组化染色,比较缺损区新骨长入情况,来评价不同硅酸钙镁含量的支架在体内的降解性、生物相容性和骨诱导作用。结果:应用sol-gel法制备的介孔硅酸钙镁(mMCS),通过电镜观察,孔径为4nm,孔道排列整齐,具有有序介孔结构。利用3D打印技术制备出的四组支架,PCL,GPC,15GMPC和30GMPC,经测量,孔隙率分别为 79.3±5.1,78.1±7.5,77.6±5.4,78.4±6.2,结果无明显差异,抗压强度分别为8.6±2.0,8.4±2.6,10.5±2.3,12.1 ±2.1,结果有统计学意义。在Tris-HCl中的降解率也逐渐增加,另外,与支架共培养的MC3T3-E1细胞,电镜下观察生长形态正常,扩散良好,吸附率和表征增殖程度的OD值逐渐增加。将不同支架组植入兔股骨远端缺损模型后,随着时间推移,所有支架均有降解,也有新骨形成。但随着mMCS含量的增加,支架残余率降低,免疫组化染色发现,Ⅰ型胶原蛋白表达量也随之增加,新骨生成区域增大。结论:根据我们得到的结果可以看出,3D打印的MGPC材料有可控的结构(孔隙率、孔径和孔连通性),良好的细胞相容性,高抗压强度,合适的降解率,能促进体内骨生成。并且随着钙镁硅酸盐含量的增加,该支架材料的抗压强度、降解性、细胞相容性和骨生成作用明显改善,其中,30GMPC支架的性能最优,有良好的应用前景,是骨缺损治疗的可行途径。