【摘 要】
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萜类家族数量庞多,结构复杂,而环化反应的出现是萜类化合物多样性的基础,在倍半萜合酶发生多步环化级联过程中,约有一半以上底物碳原子发生了键合、杂交和立体异构化。倍半萜合酶中的金属离子与法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate,FPP）发生配位作用形成法尼基阳离子,焦磷酸基团在法尼基阳离子的三号碳发起不对称攻击可形成中间体（3R,6E）-Nerolidyl diphosphate（RNP
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萜类家族数量庞多,结构复杂,而环化反应的出现是萜类化合物多样性的基础,在倍半萜合酶发生多步环化级联过程中,约有一半以上底物碳原子发生了键合、杂交和立体异构化。倍半萜合酶中的金属离子与法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate,FPP）发生配位作用形成法尼基阳离子,焦磷酸基团在法尼基阳离子的三号碳发起不对称攻击可形成中间体（3R,6E）-Nerolidyl diphosphate（RNPP）或（3S,6E）-Nerolidyl diphosphate（SNPP）,焦磷酸基团离去形成顺式的橙花叔基阳离子。法尼基阳离子异构化为顺式的橙花叔基阳离子是倍半萜合酶催化FPP发生1,6环化反应的必要条件。青蒿紫穗槐二烯合酶（Artemisia annua Amorpha-4,11-diene synthase,Aa ADS）的天然产物是紫穗槐二烯,然而Aa ADS-T296V突变体催化产物中93%为线性的（E）-β-farnesene,显著抑制了环化活性。青蒿（E）-β-法尼烯合酶[Artemisa anmua（E）-β-farnesene synthase,Aa BFS]催化产物为线性的（E）-β-farnesene,但Aa BFS-Y402L突变体催化FPP产生大量环化产物,出现显著的环化活性。T296和Y402分别是控制Aa ADS和Aa BFS 1,6环化起始的关键位点,但它们并不是对应的同源位点。本实验室前期研究发现,Aa ADS和Aa BFS催化FPP发生环化反应途经中间体分别为RNPP和SNPP,我们推测Aa ADS和Aa BFS采取不同的氨基酸位点来控制环化反应的起始可能与中间体构型之间存在一定关联。为了验证此推测,我们进行了以下研究。以10个发生1,6环化反应且同源性较低的倍半萜合酶为研究对象,分别为大冷杉（E）-α-没药烯合酶[Abies grandis（E）-α-bisabolene synthase,AgAB]、苔藓萜类合酶3（Anomodon rostratus terpene synthase 3,ArTPS3）、拟南芥萜类合酶12（Arabidopsis thaliana terpenoid synthase 12,AtTPS12）、广藿香γ-姜黄烯合酶（Pogostemon cablinγ-curcumene synthase,PcGCS）、檀香β-没药烯合酶（Santalum austrocalenicumβ-bisabolene synthase,Sa BBS）、高粱姜烯合酶（Sorghum bicolor zingiberene synthase,SbZS）、高粱（E）-β-法尼烯合酶[Sorghum bicolor（E）-β-farnesene synthase,Sb BFS]、番茄萜类合酶14（Solanum lycopersicum terpene synthase 14,SlTPS14）、番茄萜类合酶38（Solanum lycopersicum terpene synthase 38,SlTPS38）和玉米萜类合酶6（Zea mays terpene synthase 6,ZmTPS6）。通过同源建模确定与Aa ADS-T296、Aa BFS-Y402的同源位点,克隆目的基因、定点突变、表达和纯化重组蛋白,分别与底物FPP、RNPP和SNPP进行体外酶促反应,通过气相色谱火焰离子化检测器（GC-FID）和气相色谱仪（GC-MS）分析鉴定催化产物,确定发生环化过程中中间体NPP的构型以及影响倍半萜合酶催化FPP发生1,6环化反应的关键位点,得出以下结论:1.AgABS和ArTPS3体外催化FPP发生1,6环化反应途经中间体NPP为RNPP,AtTPS12、PcGCS、Sa BBS、Sb BFS、SbZS、SlTPS14、SlTPS38和ZmTPS6体外催化FPP发生1,6环化反应途经中间体NPP为SNPP。2.T292和Y369都是控制SbZS 1,6环化起始的关键位点,Y376和Y394分别是控制ZmTPS6和SlTPS14 1,6环化起始的关键位点。T303对AtTPS12催化产物特异性影响较大,SlTPS38-T295V和ZmTPS6-T299V突变体催化FPP产物特异性均发生改变。3.倍半萜合酶催化FPP发生1,6环化反应的控制机理比较复杂,中间产物构型并非是影响1,6环化起始的关键位点的唯一原因。
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