研究目的通过观察急性期脑出血(ICH)患者血液流变学指标的变化规律及其影响因素,以探讨其在脑微循环障碍中的作用机制。通过蛋白组学方法鉴定和定量急性期脑出血患者血浆差异蛋白组学的表达变化,阐述相关差异蛋白质的生物学功能、在不同细胞信号通路中的作用和功能调控网络。以期寻找脑出血后诱导脑损伤的分子标记物、筛选出特异性功能相关蛋白,为脑出血提供新的治疗靶点。对象与方法1.实验对象1.1采用临床流行病学现场调查研究的方法,选择2014年1月~2015年5月在江苏大学附属医院神经内科住院、诊断符合脑出血诊疗指南的80例急性期脑出血患者作为病例组。30例健康体检者作为对照组。病例组根据有无高血压病史、出血量大小、出血部位进行分组并分析这些指标与血液流变学的相关性。1.2选取2013年11月~2015年05月在江苏大学附属医院和江苏省中医院收治入院的新发脑出血患者8例(男、女各4例),4名健康者作为对照组,用来研究脑出血组与对照组的血浆差异蛋白的表达变化及相关蛋白的功能。2.实验方法2.1血液流变学指标检测所有患者均于入院24 h内且未行治疗之前、对照组于体检当日空腹采4 ml静脉血(肝素抗凝),采用LBY-N6B型全自动血液流变分析仪及配套试剂测定全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数和红细胞变形指数;采用温氏法测定红细胞压积;采用魏氏法测定血沉。2.2血浆差异蛋白组学测定采集4 ml空腹静脉血(EDTA抗凝),分离血浆并分装,-80度冻存;去除外周血中高丰度蛋白;蛋白质的消化和肽段的纯化(C18固相萃取小柱);i TRAQ标记蛋白质;SCX强阳离子交换柱分离蛋白;反相液相色谱分离、点靶和质谱分析;蛋白质定性和定量。3.统计学处理和生物信息学分析3.1采用IBM SPSS Statistics 22软件包进行统计学处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。3.2蛋白质定量:检测血浆蛋白组学的样本均需与每组的参比值进行比较来获得蛋白质的相对表达量。计量资料以x表示,两组间计量资料的比较采用单因变量方差分析,取两组间蛋白质表达量>1.3倍且P<0.05的蛋白质为差异蛋白。3.2利用IPA生物信息学软件对差异蛋白进行经典通路分析、疾病与功能分析、上游调控因子分析、差异蛋白的相互作用网络分析。研究结果1.脑出血患者急性期广泛存在血液流变学变化,脑出血组全血粘度(200 s-1,m Pa·s、50 s-1,m Pa·s和5 s-1,m Pa·s)、血浆粘度、血沉均高于对照组且差异有统计学意义(P<0.05)。2.高血压病史:高血压性脑出血组中高切粘度和血沉均高于非高血压性脑出血组,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。3.出血量:全血粘度和血浆粘度随着血肿量增加而升高,全血高切、中切粘度组间差异有统计学意义(P<0.05);红细胞聚集指数和红细胞变形指数随血肿量增加而下降,红细胞聚集指数在各组间差异有统计学意义(P<0.05)、而红细胞变形指数在各组间差异无统计学意义(P>0.05);低切粘度、血浆粘度、HCT和血沉在各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。4.出血部位:各组间全血高切粘度(200 s-1,m Pa·S)、全血低切粘度(1s-1,m Pa·S)、血浆粘度、红细胞聚集指数、血沉各组间差异均有统计学意义(P<0.05),其中全血低切和高切粘度以脑干组最高、小脑组最低,血浆粘度以丘脑组最高、脑干组最低,红细胞聚集指数以脑叶组最高、小脑组最低,血沉以小脑组最高、基底节组最低;全血粘度(50 s-1,m Pa·s)、(5 s-1,m Pa·s)、红细胞变形能力和HCT在各组间差异均无统计学意义(P>0.05)。5.通过蛋白质组学实验共鉴定到498个蛋白质有详细的定量信息,利用Uniprot蛋白质数据库进行GO注释结果显示这些蛋白在分子功能、细胞成分和生物学过程中共产生了43种类型的功能蛋白。6.与健康对照组相比,在ICH患者急性期组表达上调的差异蛋白有22个,表达下调的差异蛋白有14个。7.筛选出7个候选生物学标志物,分别为APCS、FGB、LBP、MGMT、IGFBP2、LYZ、APOA4。8.脑出血急性期的36个血浆差异蛋白共参与了包括LXR/RXR(肝X受体/类视黄醇X受体)激活通路、FXR/RXR(类法尼醇X受体/类视黄醇X受体)激活通路和急性期反应信号通路在内的多个经典信号通路和功能网络。结论1.急性脑出血患者广泛存在着血液流变学异常,提示脑出血急性期血液粘滞度较高,血流动力学改变与脑出血关系密切,积极监测血液流变学指标并采取相应有效措施对预防和治疗脑出血有重要的临床意义和价值。2.脑出血患者急性期所确定的36个表达上调和表达下调的差异蛋白可能共同参与和介导了急性期的脑组织损伤过程,这些差异蛋白可能成为判断脑出血预后的分子标志物及分层治疗的靶点。