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作为最早登陆的植物——小立碗藓对干旱、低温和盐胁迫都具有一定的耐受性,尤其是其抗旱性非常突出。然而,小立碗藓响应干旱耐受性机制仍旧不清楚。研究表明外源ABA能够显著提高这一绿色组织的抗旱性。 本论文研究发现,在植物激素ABA处理后,小立碗藓的抗旱性确实进一步提高,甚至达到抗干燥水平;但是,仅能耐受非常短时期的干燥胁迫。为了研究这种干燥耐受机制的分子基础,采用荧光差异电泳技术详细研究了ABA诱导下的蛋白质组变化以及通过异源表达的手段解析了关键蛋白的功能。获得主要研究结果如下: 1.荧光差异电泳显示,ABA可诱导大量小立碗藓蛋白质的表达。差异分析获得了352个表达变化超过1.5倍的蛋白点。其中绝大多数为上调蛋白点。通过MALDI-TOF/TOF-MS鉴定和数据库分析,鉴定出155个蛋白点。它们对应于98个小立碗藓基因。这些蛋白被分成11个类群,除了25个未知蛋白外,大多数蛋白归到4大类中:种子成熟,疾病应答或防御,蛋白折叠和稳定以及能量蛋白。值得注意的是,在所有上调的差异蛋白中,有54个点均鉴定为胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)。研究发现,这54个LEA蛋白点只是19个LEA基因的表达产物。根据新的命名方法,这19个小立碗藓LEA蛋白分属于5个家族,即LEA4、dehydrin、 LEA_2、LEA_6和SMP。最大的家族是LEA_4,拥有11个成员。 2.为了研究这些LEA蛋白的生理功能,运用异源表达方法,将一个小立碗藓LEA4蛋白家族成员—PpLEA4-20基因成功转入了日本晴水稻。通过大量的潮霉素抗性筛选和大田种植,获得单拷贝插入的转基因水稻。利用PCR、Southern印迹以及TAIL-PCR等方法,发现这个PpLEA4-20基因插入到水稻第4号染色体的非编码区,并且可以稳定的高表达。(1)双向电泳分析发现,大部分转基因水稻的蛋白质未发生明显变化,只有29个蛋白点发生了超过2倍的变化。意外的是,在转基因水稻叶片的双向电泳图谱中,发现了2个高表达的PpLEA4-20蛋白点。上述结果表明苔藓PpLEA4-20蛋白在水稻细胞里是完全相溶性的,并具有某种未知的修饰。(2)生长和生理分析显示,幼苗期的转PpLEA4-20基因水稻与野生型相比,表现较好:地上部分明显较高,而根系却粗短而浓密,抗旱能力却不明显;然而转PpLEA4-20基因水稻对盐胁迫具有一定的抗性,在盐胁迫条件下其电解液渗透率降低,表明该蛋白对细胞膜具有一定的保护性。(3)抗凝集分析发现,PpLEA4-20蛋白具有热稳定性,它甚至可提高某些水稻蛋白在高温下的稳定性。通过Nano LC-MS/MS分析,这些高温下稳定的水稻蛋白已被鉴定。它们是二氢硫辛酸脱氢酶、甲基-CPG结合蛋白、硫胺素生物合成蛋白、类萌蛋白、核糖体循环因子等。推测这些蛋白质可能是PpLEA4-20蛋白的靶标分子。外源PpLEA4-20蛋白也能够保护一些水稻蛋白在热处理下不凝集,从另一个角度说明了该蛋白具有蛋白保护功能的可能机制。综合上述结果,认为PpLEA4-20蛋白的转入可提高水稻幼苗的抗盐性。这可能归因于它对细胞膜和靶标蛋白的保护作用。 本论文的研究对深入揭示小立碗藓的ABA诱导早期抗旱的蛋白质组学及其关键LEA蛋白的功能具有一定意义。