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肉品质是猪的重要经济性状之一,它与人体营养、肉品加工和养猪经济都有着密切的关系。磷酸丙糖异构酶l(Triosephosphateisomerasel,TP[1)是在糖酵解过程中,催化3.磷酸甘油醛与磷酸二羟丙酮之间的互变。近年,无论在对猪宰后蛋白质组变化过程、还是中外猪品种间差异表达蛋白的研究中,都发现它与猪肉品质呈现显著的相关性。本研究以比较基因组学和生物信息学理论为基础,采用电子克隆、cDNA末端快速扩增、测序、基因表达差异分析等方法,克隆并鉴定了猪TPIl基因的全长cDNA,并进行了序列分析、蛋白质结构功能预测、进化分析、基因组结构分析、cSNP筛查、电子表达谱分析及远缘品种间的差异蛋白基因mRNA水平定量研究,主要研究结果如下:
l、参照人、鼠TPIl基因的mRNA序列,采用电子克隆等生物信息学手段,结合RACE技术,克隆并鉴定了猪TP[1基因全长cDNA序列,长度为1296bp,提交GenBank收录,登录号为DQ437525。
2、用DNAstar软件,结合网络资源,对猪TPIl基因全长cDNA序列进行分析,结果发现:5’非翻译区为46bp,3’非翻译区为503bp,开放阅读框为747bp,编码248个氨基酸。核酸同源性分析发现,该基因的全长cDNA与人、鼠之间的同源性分别为87%和85%。
3、应用生物信息学方法,分析该基因编码的蛋白质的序列、结构和功能,结果显示:该基因编码的氨基酸序列与牛、人和鼠的TP[1同源性分别为96%、95%和93%;该蛋白质上不存在明显的信号肽断裂位点,在其164~174处为TPIl活性位点,还有l处为酰胺化位点,6处为豆蔻酰化位点,6处为蛋白激酶C磷酸化位点,2处为酪蛋白激酶II磷酸化位点,同时具有类似于lhtiA与lHTIchainB类的3D结构。
4、参照人和鼠TP[1基因的基因组结构,根据猪TPIl基因的全长cDNA序列,设计特异性引物,克隆了猪TP[1基因的6个内含子。内含子l为¨27bp,内含子2为114bp,内含子3为74bp,内含子4为289bp,内含子5为518bp,内含子6为105bp。将其和外显子合成一个片段提交GenBank收录,登录号为DQ452969。
5、以若干蓝塘猪与大白猪的cDNA为模板,对两个品种的PCR产物进行克隆,比较、分析测序结果后发现:在CDS序列上有4个位点存在SNP,其中1个是错义突变,即C372T(Pro—Leu),导致了氨基酸的变化,对蛋白的性质有较大影响;3个为同义突变,即A433G、C559T、C673T,可能存在某种调节功能。
6、以猪TPll基因全长cDNA序列为基序,利用Unigene数据库进行电子表达谱分析,结果发现,该基因无论在肌肉、血液、肝脏、垂体、卵巢、子宫、睾丸、淋巴、呼吸道和胎盘的组织中,还是在胚胎期、青年期和成年期均有表达。电子Northern杂交显示:组织表达量从高到低次序为,睾丸、肌肉、卵巢、血液、呼吸道、垂体、淋巴、肝脏、胎盘和子宫;成年和青年期具有相同的表达量,相比而言胚胎期表达量低于前者,胎儿期几乎不表达。
7、对蓝塘猪与大白猪眼肌组织差异蛋白基因进行mRNA水平的实时荧光定量PCR分析,结果显示,TPIl基因在蓝塘猪中的表达量高于大白猪,且差异极显著(P<0.05),说明了TP[1基因在品种间蛋白质水平表达差异和mRNA水平表达差异基本是一致的。细胞色素P45017Al基因、肌钙蛋白快骨骼肌亚型(troponin[,fastskeletalmuscle)基因、肌钙蛋白慢骨骼肌亚型(troponinTslowtypeisoformsTnTl)基因在蓝塘猪中表达量均高于大白猪,但差异都不显著。