背景烟草危害是当今世界上最严重的公共卫生问题之一,长期吸烟可能导致多种疾病。吸烟可以成瘾,称为烟草依赖,许多吸烟者存在不同程度的烟草依赖,尽管部分吸烟者有着强烈的戒烟欲望,但戒烟者大多在一周内复吸。研究表明,烟草中导致烟草依赖的主要物质是尼古丁。在尼古丁戒断后会产生一系列戒断症状,其中,焦虑和尼古丁渴求两种行为表现十分明显,它们均能诱发患者复吸,故缓解尼古丁戒断后的焦虑和渴求表现将有助于治疗尼古丁成瘾从而帮助患者戒烟。目前常用于治疗尼古丁依赖的方法有尼古丁替代治疗和非尼古丁治疗,但大多药物副作用较多,或也具有一定的成瘾性。因此,找到能有效治疗尼古丁成瘾且副作用小的药物对临床上治疗尼古丁成瘾并帮助戒烟具有重大意义。黑果枸杞为茄科(Solanaceae)枸杞属黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murray)的果实,广泛应用于传统民族医药学。黑果枸杞富含多种成分,其中花色苷类成分被认为是黑果枸杞的主要活性成分之一。现有研究表明,黑果枸杞花色苷具有抗氧化、清除自由基、调节血脂、抗衰老等生理活性。课题组前期工作研究发现黑果枸杞花色苷提取物具有稳定的抗焦虑作用,其作用机制包括降低促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)含量、调节胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)通路等,与尼古丁成瘾机制相关。但黑果枸杞的抗焦虑作用能否应用于对尼古丁成瘾的治疗仍待进一步研究,明确这一问题对于黑果枸杞花色苷的开发应用具有良好的社会意义和经济价值。因此,本研究提取纯化得到纯度较高的黑果枸杞花色苷,阐明其成分类型,明确其对尼古丁戒断后的焦虑及渴求的影响,并探究其作用机制,以期为黑果枸杞花色苷应用于治疗尼古丁成瘾提供理论及实验基础,为临床上治疗尼古丁成瘾并帮助戒烟提供参考。目的本研究拟优化大孔树脂纯化黑果枸杞花色苷的工艺,并分析纯化物中花色苷类化合物结构;研究黑果枸杞花色苷对尼古丁戒断后焦虑和渴求表现的影响及作用机制,为把黑果枸杞花色苷开发成能够长期服用、安全有效的戒烟产品奠定基础。方法1黑果枸杞花色苷纯化工艺的优化通过水浴加热法提取得到黑果枸杞花色苷粗提物,再通过单因素考察结合Box-Behnken响应面法,对X-5大孔树脂纯化黑果枸杞花色苷过程中,影响吸附与解吸效果的因素条件进行优化,得到稳定的纯化工艺参数并得到纯度较高的黑果枸杞花色苷。2黑果枸杞花色苷成分分析按最优工艺条件纯化得到黑果枸杞花色苷纯化物,采用UPLC-Orbitrap MS法对其进行检测分析,初步鉴别黑果枸杞花色苷的成分类型。3黑果枸杞花色苷对小鼠尼古丁戒断后所致焦虑的影响采用小鼠高架十字迷宫和明暗箱实验评价不同剂量(1 g/kg、2 g/kg、3 g/kg)黑果枸杞花色苷抗焦虑的作用,考察其对小鼠尼古丁戒断后所致焦虑的影响。4黑果枸杞花色苷对小鼠尼古丁戒断后渴求的影响建立尼古丁诱导的小鼠条件位置偏爱成瘾模型,在消退后再用尼古丁诱导条件位置偏爱表达的恢复,并在消退期给予黑果枸杞花色苷(3 g/kg)治疗,评价其对成瘾小鼠戒断后渴求表现的影响。5黑果枸杞花色苷类成分治疗尼古丁成瘾的作用机制初探利用网络药理学分析黑果枸杞花色苷的作用靶点,构建“成分-靶点-疾病”网络,并进行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析,初步探讨其治疗尼古丁成瘾的作用机制。结果1黑果枸杞花色苷纯化工艺的优化X-5大孔树脂纯化黑果枸杞花色苷的最佳工艺条件为:大孔树脂径高比1:15,上样液浓度32 g/L,上样液pH=2.7,上样流速1 mL/min;洗脱剂浓度92%,洗脱剂pH=3.6,洗脱流速1 mL/min,洗脱剂体积3.31 BV。在此条件下,黑果枸杞花色苷的产率为8.01%,色价为33.8,是纯化前色价的17.79倍。2黑果枸杞花色苷成分分析按最优工艺条件纯化得到的黑果枸杞花色苷纯化物中,含有21种花色苷及花青素类成分,包括10种以矮牵牛素为母核的花色苷,4种以飞燕草素为母核的花色苷,2种以锦葵素为母核的花色苷,1种以矢车菊素为母核的花色苷以及4种原花青素。其中矮牵牛素-3-O-阿魏酰芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷和矮牵牛素-3-O-阿魏酰芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷的甲基化衍生物在黑果枸杞中首次报道。3黑果枸杞花色苷对小鼠尼古丁戒断后所致焦虑的缓解作用在高架十字迷宫实验中,黑果枸杞花色苷中剂量(2 g/kg)和高剂量(3 g/kg)能显著增加尼古丁戒断小鼠进入开臂时间百分比,高剂量还能显著增加小鼠进入开臂次数百分比。在明暗箱实验中,黑果枸杞花色苷低(1 g/kg)、中、高剂量均能显著增加尼古丁戒断小鼠进入明箱的时间,高剂量还能显著增加小鼠进入明箱的次数。4黑果枸杞花色苷对小鼠尼古丁戒断后渴求的缓解作用在表达期,模型组的条件性位置偏爱(CPP)评分显著高于空白组,且与基线数值相比也有极显著的增加;经过3d的消退期,模型组和治疗组的CPP评分与表达期相比显著降低;再次接受尼古丁后,模型组小鼠的CPP评分显著高于空白组,且与消退期数值相比也显著增加,治疗组小鼠在重建期的CPP评分显著低于模型组,且与消退期数值相比无显著差异。5黑果枸杞花色苷类成分治疗尼古丁成瘾的作用机制初探黑果枸杞花色苷及花色素类成分可能通过作用于IL2、APP、SRC、MMP9、ESR1、PIK3R1、MCL1、EGFR、AKT1、MMP2、SIRT1、IGF1R、KDR、PTGS2、TNF来调节信号传导,参与多巴胺、胆碱等神经系统功能,以及影响雌激素、血清素、催乳素、催产素等生物分子的产生和传递,从而发挥治疗尼古丁成瘾的作用。结论本课题优化了 X-5大孔树脂纯化黑果枸杞花色苷的工艺条件,得到稳定的纯化工艺参数,该工艺简单可行且纯化效果良好,适用于黑果枸杞花色苷的纯化。从黑果枸杞花色苷纯化物中共鉴定出21种花色苷及花青素类成分,其中2种花色苷在黑果枸杞中首次报道,明确了黑果枸杞花色苷成分类型,丰富了学者对黑果枸杞花色苷成分的认识,为后期的研究与产品的开发提供了基础。黑果枸杞花色苷表现出对尼古丁成瘾小鼠戒断后焦虑症状的治疗作用,并能抑制戒断后尼古丁诱导的条件位置偏爱的恢复,表现出对小鼠尼古丁戒断后渴求行为的治疗作用。初步推测其机制是调节多巴胺、胆碱等神经系统中的信号传导,以及调节雌激素、血清素、催乳素、催产素等生物分子的产生和传递。黑果枸杞花色苷从抗焦虑和缓解渴求两方面表现出对尼古丁戒断症状的治疗作用,有望开发为治疗烟草成瘾并帮助戒烟的安全有效的戒烟产品。