作为中枢神经系统所有原位肿瘤中最常见的肿瘤,胶质瘤大概占颅内恶性肿瘤的50%左右。美国每年有超过14000位新患者被诊断出脑胶质瘤,其每年的全国发病率为0.005%。其中胶质母细胞瘤患者占总数的60-70%,间变性星形细胞瘤占10-15%,间变性少突胶质细胞瘤和间变性少突星形细胞瘤大约占10%,其余为罕见的肿瘤如间变性室管膜瘤和间变性神经节细胞胶质瘤。因为大部分胶质瘤为浸润性、弥漫性生长,与周边正常脑组织边界不清而且容易复发,故患者治愈率低、预后欠佳、总体生存期较短。尽管采取了最佳的治疗方案包括手术切除辅以放疗和(或)化疗等综合性治疗,胶质母细胞瘤患者的中位生存期仅仅为12.15个月,间变性胶质瘤患者则为2-5年。在胶质瘤临床化学药物治疗中,相当数量的胶质瘤对化疗产生耐药性是后期治疗效果欠佳的主要原因,现在一线临床化疗药物的实际有效率仅仅维持在20-30%左右。所以,有效解决化疗药物的耐药性成为提高胶质瘤患者预后生存率的重要途径。因此,研究胶质瘤中调节细胞耐药行为的相关基因有助于我们进一步了解耐药的分子机制,同时可以指导临床制定胶质瘤患者的个性化化疗方案并判断预后,这还为将来胶质瘤的分子生物学治疗提供相对理想的靶标基因。作为磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的新成员,PEBP4在人体各组织中都有一定的表达,它参与质膜生物合成、神经元发育、精子的形成、细胞凋亡等生理及病理生理过程,是一类体内普遍存在的多功能复合型蛋白。近期相关研究表明PEBP4在肿瘤细胞中多方面的起着抗凋亡的生理病理作用,使其在肿瘤的发生发展过程中具有癌基因的功能同时发挥促癌作用。在肿瘤细胞中高表达的PEBP4可以抑制TNF-a(肿瘤坏死因子-α)或者TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)诱导的细胞凋亡,包括抑制凋亡相关蛋白p53, p21CIP/WAF和BAX(Bcl2-相关X蛋白)的表达,同时提高凋亡抑制蛋白Bcl2和Bcl-XL的表达。另外,PEBP4不仅参与MAPK信号通路的抑制,而且抑制JNK信号通路同时激活AKT通路,从而影响肿瘤细胞的细胞周期和凋亡。由此可见PEBP4是肿瘤细胞中调节多条信号通路的关键因子,而这些上游的信号通路恰好能调控肿瘤细胞的生长、分裂及凋亡,所以更深入地研究PEBP4将有助于进一步了解肿瘤细胞的复杂生物学机制。本实验拟在探讨PEBP4在脑胶质瘤中的具体生物学功能,我们首先明确PEBP4在不同级别的胶质瘤组织和正常脑组织中的基因和蛋白表达情况,并分析其表达与相关临床资料特别是患者预后的相关性。其次,利用小片段RNA干扰和慢病毒载体干扰技术,构建PEBP4不同表达水平的细胞株,同时观察其对胶质瘤细胞株增殖、侵袭及细胞周期等恶性生物学的影响。随后,检测PEBP4干扰后胶质瘤细胞株增殖、侵袭、细胞周期及凋亡相关蛋白的表达情况,明确PEBP4分子与ERK1/2信号通路可能存在的相互关系。最后,我们将PEBP4干扰后的细胞株与替莫唑胺进行共同培养,观察PEBP4表达对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。本次实验共分三部分：第一部分,PEBP4在不同级别脑胶质瘤组织中的表达水平以及其与患者预后的相关性；第二部分,通过PEBP4慢病毒干扰载体感染胶质瘤细胞株,观察PEBP4表达变化对胶质瘤细胞株增殖、侵袭和细胞周期的影响,同时利用shRNA干扰细胞PEBP4的表达,研究ERK1/2通路对胶质瘤增殖、侵袭及凋亡的影响；第三部分,观察不同表达水平的PEBP4对胶质瘤细胞株替莫唑胺敏感性的影响及可能的机制,探讨shRNA-PEBP4联合替莫唑胺作用对细胞株克隆能力影响。第一部分PEBP4在胶质瘤临床组织标本中的表达研究目的：研究PEBP4在不同级别胶质瘤临床组织标本中的mRNA和蛋白表达水平,探讨PEBP4表达与临床病理因素的关系以及对患者预后的影响。方法：应用免疫组织化学及Western blot检测PEBP4在58例不同级别胶质瘤组织的蛋白表达水平,同时运用Real-time PCR检测PEBP4的mRNA表达水平。通过统计学方法验证其与临床病理因素之间的关系以及对胶质瘤患者预后的影响。结果：肿瘤组织中PEBP4的mRNA表达可能与胶质瘤级别呈正相关(p<0.05),同时PEBP4的蛋白表达相对于正常脑组织有明显增高,这与mRNA的表达情况是一致的,而且PEBP4的蛋白表达随着胶质瘤级别的变高而显著增强(p<0.05)。免疫组化检测发现PEBP4主要在细胞质及细胞膜中表达,在胞浆中呈弥漫性分布,棕色或棕黄色颗粒主要集中在细胞膜。临床研究发现,PEBP4表达与患者年龄、性别、KPS评分均无统计学意义,但是与胶质瘤WHO分级关系密切(p=0.023)。单因素和多因素Cox回归显示,胶质瘤患者的生存时间与WHO分级(p=0.013)和PEBP4表达(p=0.006)明显相关。进一步的多因素Cox回归分析发现,在所有的临床病理因素和生化参数中,PEBP4表达是判断胶质瘤预后的唯一独立因素。并且PEBP4的高表达提示胶质瘤患者的不良预后。结论：随着胶质瘤病理级别的增高,PEBP4的基因和蛋白表达同时随之上调。同时相对于其它临床因素,它是影响患者预后的独立干预因素,并且PEBP4的高表达提示胶质瘤患者的不良预后。第二部分PEBP4在胶质瘤细胞中的功能及分子机制研究目的：利用慢病毒载体抑制胶质瘤细胞U251和U373中PEBP4的表达,探讨PEBP4变化对胶质瘤细胞株U251和U373增殖、侵袭和凋亡的影响。同时观察shRNA干扰PEBP4表达后的胶质瘤细胞株中U251和U373细胞周期、增殖、侵袭及凋亡的相关重要因子表达。并且进一步研究细胞株U251中PEBP4表达下调后,ERK1/2信号通路相关蛋白的变化。方法：运用PEBP4慢病毒干扰载体感染U251、U373细胞株,构建PEBP4低表达的胶质瘤细胞系。MTT法测定细胞增殖能力,Transwell试验检测侵袭水平,流式细胞仪测定细胞周期改变。Western blot测定肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡相关蛋白p-Rb、Cyclin D1、E-cadherin、Bcl-2及caspase-3的变化,同时测定ERK1/2信号通路的变化。进一步实验中使用ERK1/2信号通路的特异性抑制剂U0126处理感染后的细胞株U251,利用Western blot检测ERK1/2以及相关蛋白的变化,再次运用MTT检测各组肿瘤细胞的增殖改变。结果：shRNA-PEBP4干扰载体构建结果满意,慢病毒包装成功,感染U251和U373细胞后可显著下调PEBP4的表达。MTT检测结果说明,干扰PEBP4表达后胶质瘤细胞U251和U373的增殖能力明显减弱(p<0.05)；侵袭性试验表明PEBP4表达下调后肿瘤细胞的侵袭能力则显著降低(p<0.01)；细胞周期检测发现PEBP4干扰病毒载体转染U251和U373后,细胞出现明显的G0/G1期阻滞,S期和G2/M期缩短(p<0.05)。进一步Western blot结果证实,PEBP4干扰后的U251和U373细胞中,p-Rb和细胞周期相关因子Cyclin D1表达下调,而侵袭相关蛋白E-cadherin上调,促凋亡因子caspase-3表达增加,抗凋亡因子Bcl-2表达则减少,同时ERK1/2磷酸化水平升高,而总ERKl/2则没有影响。使用特异性抑制剂U0126干扰ERK1/2通路后,Western blot结果显示caspase-3表达上调,Bcl-2表达则降低,表达趋势与PEBP4干扰后的检测结果相似,然而PEBP4的蛋白表达则无明显变化。最后在shRNA-PEBP4处理后的U251细胞株中加入ERK1/2抑制剂U0126,结果显示shR-PEBP4+NC组相对shR-ctrl+U0126组,肿瘤细胞的增殖能力明显下降,这提示了ERK1/2可能是PEBP4的下游效应分子。结论：PEBP4可能是通过调控ERKl/2信号通路,间接影响肿瘤细胞的周期进程,从而导致胶质瘤细胞的增殖、侵袭及凋亡能力的改变。第三部分PEBP4表达对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响目的：探讨PEBP4干扰对胶质瘤细胞系U251MG和U373MG对化疗药物替莫唑胺(TMZ)敏感性的影响。方法：使用PEBP4慢病毒干扰载体感染U251、U373细胞株,建立PEBP4不同表达水平的U251、U373细胞系。此细胞系与不同浓度替莫唑胺共培养三天,MTT法测定第三天的细胞抑制率并计算各个IC50值。软琼脂培养克隆形成试验检测替莫唑胺对U251、U251-shRNA、U251-GFP及U373、U373-shRNA、U373-GFP克隆形成能力的影响。通过Western blot检测U251、U373细胞中PEBP4干扰后多药耐药蛋白(P-gp,MRP1)及DNA损伤修复酶(MGMT, MMR)的变化。结果：利用3天MTT法测肿瘤细胞生长抑制率并计算IC50,结果在U251和U373细胞株中单独使用TMZ的耐药指数分别为23.26±2.44ug/mL和21.65±2.01ug/mL,同时U251和U373的空载体组与TMZ联合作用的耐药指数分别为21.33±1.27ug/mL和22.78±1.88ug/mL,然而干扰PEBP4表达组与TMZ联合后U251和U373细胞对TMZ的耐药指数分别为9.78±1.03ug/mL和8.06±1.82ugmL,相当于前二组指数明显下降(p<0.05)。在替莫唑胺浓度分别为0、0.05、0.10、0.15μmol/L时培养72h,U251-shRNA细胞组的克隆存活率分别为0.745±0.09、0.34±0.08、0.09±0.01、0.015±0.001, U373-shRNA细胞组的克隆存活率分别为0.713±0.16、0.29±0.07、0.06±0.01、0.01±0.001,结果表明,在TMZ浓度相同的情况下,二组细胞系中PEBP4干扰组的克隆存活率均显著低于对照组及空白组(p<0.05)。抑制PEBP4表达后,U251及U373细胞株中P-gp和MRP1的蛋白表达均无变化,而MGMT和MMR的蛋白表达均显著下降。结论：PEBP4表达下调后可以增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的药物敏感性,shRNA-PEBP4联合替莫唑胺可以明显降低肿瘤细胞的克隆能力,这可能是因为通过影响胶质瘤细胞DNA损伤修复酶及凋亡的作用。