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微小RNA(microRNAs,miRNAs)是近年来发现的一类长约21-25个核苷酸的内源性单链非编码RNA,在动植物中均有表达。miRNAs通常与靶mRNAs的3’-非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)互补结合,在转录后水平抑制靶基因的表达。miRNAs调节细胞增殖、凋亡、分化以及迁移等重要的生物学过程。miRNAs表达和代谢的异常还与多种疾病,比如肿瘤密切相关。一些miRNAs在肿瘤组织中表达异常,促进了肿瘤的发生和进展,其作用相当于癌基因或抑癌基因。目前,已有证据提示miRNAs可应用于肿瘤的基因诊断和治疗。应用高通量的生物芯片技术,科学家已在多种人类肿瘤,如肺癌、乳腺癌、肝癌、食管癌和前列腺癌等中筛选出表达异常的miRNAs。其中,Hsa-miR-141(miR-141)作为miR-200家族的成员之一,在乳腺癌、结直肠癌细胞株和胆管癌细胞株中表达增高,而在前列腺癌、肝细胞肝癌和肾细胞癌中表达降低。异常表达的miR-141参与了胆管癌细胞的增殖和肾癌细胞的侵袭活动,提示miR-141与多种肿瘤的发病机制相关。胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一,是男性肿瘤的第二死因,女性肿瘤的第三死因。2008年,美国新增的胃癌患者估计有21,500例,新增的胃癌死亡患者约10,880例。在中国每年新增约36-40万胃癌患者,死亡率占据我国肿瘤死因的第二位。但是,我们对胃癌发病机制尚缺乏全面和深入的了解。最近研究发现miR-106b-25簇、miR-21和miR-27a在胃癌中的表达增加;同时,肠型胃癌和未分化型胃癌均有特征性的miRNAs表达谱,提示miRNAs与胃癌的发病机制有密切的联系。在本课题中,我们利用生物芯片技术筛选在胃癌组织和癌远端非肿瘤组织中差异表达的miRNAs,并通过定量Real-time PCR技术检测miR-141在胃癌患者肿瘤组织和胃癌细胞株中的表达状态;同时采用现代细胞与分子生物学技术,通过体外胃癌细胞模型研究miR-141在胃癌发病机制中的作用,为胃癌早期诊断和寻求药物靶点提供科学的依据。1材料和方法1.1收集胃癌患者手术组织样本,通过miRNAs芯片筛选在胃癌组织及癌远端非肿瘤组织中差异表达的miRNAs,并用定量Real-time PCR验证miR-141的表达情况。然后使用独立样本t检验和单因素方差检验分析miR-141表达水平与各临床病理参数之间的相关性。1.2使用定量Real-time PCR分析5株胃癌细胞株中miR-141的表达情况,结合细胞的增殖和分化特征,筛选合适的胃癌细胞株。1.3使用miR-141 precursor molecule转染方法在MGC-803胃癌细胞内过量表达miR-141,通过相差显微镜观察以及MTT检测研究过量表达miR-141对细胞增殖的影响。1.4使用生物信息学方法(如miRanda,Pictar,Targetscan等)预测miR-141靶基因,结合既往文献筛选与胃癌发病机制相关的靶基因,并进行初步验证。2主要结果2.1生物芯片结果发现,与癌远端非肿瘤组织相比,胃癌组织中的miR-141下调了大约12.0倍。使用定量Real-time PCR发现在80%的胃癌组织样本中miR-141的表达水平下调,平均下降2.1倍(P<0.01)。但miR-141的表达水平与各临床病理参数之间无显著相关性。2.2筛选出来源于胃癌的MGC-803细胞株为合适的体外细胞模型。用miR-141 precursor转染MGC-803细胞后,细胞中miR-141的表达上调了大约7×10~4倍;而pre-miR negative control转染的细胞在荧光显微镜下几乎均显示为红色,提示miR-141 precursor在MGC-803细胞中转染成功且过量表达了miR-141。2.3用相差显微镜和MTT法观察miR-141 precursor过量表达48小时和72惺焙蟮腗GC-803细胞。与pre-miR negative control转染组相比,两种方法均提示miR-141 precursor转染组细胞的增殖受到显著抑制(48小时,P<0.05;72小时,P<0.01)。2.4使用生物信息学方法分析,预选出miR-141的靶基因是FGFR2和ZEB2。但定量Real-time PCR检测未显示过量表达miR-141的MGC-803细胞内FGFR2和ZEB2的mRNA水平有显著改变。3结论3.1基因芯片和定量Real-time PCR发现在胃癌患者的肿瘤组织中,miR-141的表达水平与癌远端非肿瘤组织相比显著减少,提示miR-141的表达下调可能与胃癌的发病机制有关。3.2过量表达miR-141后MGC-803细胞增殖受到显著抑制,显示miR-141表达水平可能参与细胞增殖的分子调控,有可能成为胃癌治疗的分子靶点。3.3关于FGFR2和ZEB2是否为miR-141与胃癌相关的靶基因,还需要继续扩大研究,深入探索并验证之。