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有机阴离子转运多肽(Organic anion transporting polepeptides,OATPs)属于溶质转运体(Solute carrier,SLC)超家族,是一类重要的药物摄取转运体。按照氨基酸序列的同源性它们被分为6个亚家族。OATPs是一类多特异性的转运体,它们介导非钠离子依赖的广泛的两亲有机溶质的转运,包括胆汁盐、类花生酸、有机染料、甾体激素缀合物、甲状腺激许多药物和其他外源性物质。其中OATP1B1与OATP1B3是该类转运蛋白的重要成员,它们主要分布在人肝细胞膜的基底外侧膜上,在肝细胞的药物清除中发挥重要作用。OATP1B1与OATP1B3包含12个跨膜区,且两者的同源性高达80%,因此两者在结构与功能方面具有很大的相似性。其中雌酮-3-硫酸酯(Estrone-3-sulfate,E3S)是OATP1B1与OATP1B3共同的底物。然而当儿茶素类化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)与 E3S 同时给药时,EGCG 能激动 OATP1B3对E3S的摄取,但是却抑制OATP1B1对E3S的摄取。有文献报道OATP1B3可被其他小分子激动,但对小分子激动OATP1B3的分子机制研究目前并没有文献报道。因此本论文的主要研究目标即是确定OATP1B3中哪些结构域和氨基酸残基对小分子的激动起重要作用,为此我们构建了 OATP1B3的12个嵌合蛋白,即OATP1B3的12个跨膜区域分别用OATP1B1对应的部分进行替换。功能研究结果表明,当OATP1B3的TM1和TM10被OATP1B1对应的部分替换时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用显著降低,甚至呈现抑制的趋势。以上结果表明,TM1与TM10这两个跨膜区是对小分子的激动起重要作用的结构域。将OATP1B1与OATP1B3在TM1的氨基酸序列进行比对发现,两者在TM1有五个氨基酸不同。为了进一步确定哪几个氨基酸是起主要作用的,我们将OATP1B3中的五个氨基酸残基分别突变为OATP1B1中对应的氨基酸残基,得到OATP1B3-F27L、F36L、Y38F、A42T和G45A五个单突变蛋白。功能研究表明,当OATP1B3在45位的氨基酸由柔性最大的甘氨酸突变成丙氨酸时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用显著降低。类似地,OATP1B3在TM10有14个氨基酸与OATP1B1不同,通过定点突变,我们得到了 14个单突变蛋白,分别为OATP1B3-N528D、T529A、F535Y、I536F、Y537F、I543L、S545L、L546F、T550L、T554S、F555H、I556V、L557M和T559I。功能实验表明,当OATP1B3在555位的氨基酸由芳香族苯丙氨酸突变成带正电荷的组氨酸时,激动作用显著降低。因此在野生型OATP1B3转运体中45位的甘氨酸以及555位的苯丙氨酸是对小分子EGCG的激动起主要作用的氨基酸残基。为了进一步将确定45和555位点氨基酸结构特征对OATP1B3激动的影响,我们将45位柔性最大的甘氨酸分别突变成含有羟基的丝氨酸、芳香族的苯丙氨酸、带负电的天冬氨酸、带正电的赖氨酸,得到1B3-G45S,1B3-G45F,1B3-G45D,1B3-G45K;同样类似地,将555位的苯丙氨酸突变成芳香族色氨酸与酪氨酸,得到1B3-F555W,1B3-F555Y。功能实验表明,当45位的甘氨酸突变成以上氨基酸时,小分子调节剂EGCG对OATP1B3的激动作用也是显著降低的,说明45位的甘氨酸柔性可能是发挥激动作用的关键因素。当555位芳香族的苯丙氨酸突变成带正电荷组氨酸时,EGCG对OATP1B3的激动显著降低,而当555位的苯丙氨酸突变成不带电荷的芳香族氨基酸色氨酸与酪氨酸时,EGCG对OATP1B3仍起激动作用。以上结果表明,555位的正电荷不利于OATP1B3的激动。