背景与目的血友病(Hemophilia)是一组由于血液中某些凝血因子的缺陷而导致患者产生严重凝血障碍的遗传性出血性疾病,男女均可发病,但绝大部分为男性。主要分型为A型血友病(甲型血友病)、B型血友病(乙型血友病)、因子XI缺乏症(曾称丙型血友病)和其他因子缺乏症。血友病在先天性出血性疾病中最为常见,出血是该病的主要临床表现。而临床上最常见的血友病有A型血友病(hemophilia A, HA)和B型血友病(hemophilia B, HB)两型,分别是由于凝血因子Ⅶ(FⅧ)和凝血因子IX(FIX)基因缺陷所引起,均为X连锁隐性遗传。在男性血友病患者中,HA占80%-85%,而HB仅占15%-20%,且HB在男性中的发病率大约为1/30000[1],远低于HA,女性患者更是罕见。目前血友病的主要治疗方案为向机体内补充凝血因子等血浆替代疗法来预防或控制血友病出血症状。由于血友病是一种遗传性疾病,必须针对其对应基因进行治疗,才有可能根治。因此,有必要对该病的基因突变类型进行进一步的研究分析,从而建立起有效的基因诊断体系,为基因治疗提供重要的依据。B型血友病,又称Christmas Disease,机制为FⅨ基因缺陷导致血浆中FIX含量减少或功能异常使凝血因子的凝血活性降低或缺失,从而形成严重的凝血功能障碍。临床上根据凝血因子Ⅸ活性可分为轻型(5%<FIX:C<40%)、中型(5%<FIX:C<1%)和重型(FIX:C<1%)。1985年,Yoshitake[41等人完成了FIX基因的全序列分析。可知,FⅨ基因的长度为33.5kb,由8个外显子和7个内含子以及侧翼序列组成,其8个外显子对应编码FⅨ蛋白的6个结构域。1990年George Brownlee首次建立了HB基因突变数据库[5]。目前最新发布的FIXMutation Database(第12版)[6]共收录了2891例病人,涵盖了包括91例大缺失或插入在内的962种惟一突变。随着世界范围对HB研究的深入和HB患者被发现病例数的增加,突变数据库正在不断更新,新的突变正被人们所发现和认识。根据数据库内,突变在基因内蛋白区域和控制区域的分布显示,FIX基因的突变具有明显的高度的异质性[7],可发生在FIX基因外显子、内含子、启动子及其侧翼序列的任何位置[8]。已知的FIX基因突变类型包括错义突变、无义突变、小的插入和缺失等[9],其中错义突变占60%以上当前,HB及携带者的基因诊断方法大致可为间接法和直接法两大类[10]。对具有明确家族史和先证者的家系,可联合多个STR多态性位点,采用限制性片段长度多态性(RFLPs)、短串联重复序列(STR)和单核苷酸多态性标记(SNP)等间接基因诊断方法对HB进行基因诊断。用PCR扩增目的基因,然后进行异源双链分析的直接诊断方法有变性梯度凝胶法(DGGE)、单链构象多态性(SSCP)等。对于无家族史或先证者的散发HB病例和携带者进行基因诊断和产前诊断,即使利用多态性位点的连锁分析方式也会出现无法诊断的现象。当运用SSCP、DGGE等直接检测方法发现有异常时,仍需要进一步进行基因序列分析以确定具体突变[11],且SSCP等方法都存在复杂费时且敏感性低等问题。近年来,随着PCR技术的不断成熟及FIX基因较小及其他相关因素等原因,国内外许多研究组对HB患者的基因诊断采用全基因测序的方法取代他法,均取得了较好的结果[12、13、14、15]。本研究在文献资料及其他研究基础上设计合成了覆盖FIX基因8个外显子及其侧翼序列在内的8对引物,应用聚合酶链反应(PCR)及DNA测序技术对31例HB患者进行FⅨ基因突变检测,并通过Chromas软件在Blast上将测序结果与正常序列进行比对,寻找到基因突变具体位置。将研究收集的所有HB患者FIX基因直接测序所得的基因突变结果进行分析,得出突变具体位置、类型、氨基酸改变。31例患者基因突变检测及分析,对于明确FIX基因突变机制有重要意义,为基因治疗的发展提供了分子依据,同时也为世界HB突变数据库进行了必要的补充,是世界范围对HB研究的重要组成部分。材料与方法1.研究对象来自南方医院血液科及妇产科门诊,31个无亲缘关系HB家系中的31例HB患者,临床均有不同程度的出血现象,且所有患者的FIX活性(factor Ⅸactivity,FIX:C)测定均<5%。2.标本采集及DNA提取静脉采集HB患者外周血2m1,以乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)进行抗凝。实验室中,用外周血DNA提取试剂盒(美国Life公司)提取基因组DNA,-20℃保存备用.3.引物设计和PCR扩增根据FIX基因序列(Gene Bank K02402),参照相应文献[16]设计并合成8对引物,8对引物覆盖FIX基因的外显子全部区域及其侧翼序列,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应总体积为50μl,加入上游和下游引物各5pmol(终浓度为0.1μM),四种dNTP各5nmol(终浓度为0.1mM),5μl×Taq PCR Buffer(100mM Tris-HCl,15mM MgCl2和500mM KCl,pH8.3),2U Taq DNA聚合酶(TAKARA公司),基因组DNA50-200ng。所有PCR扩增反应在美国PE公司的9700型热循环仪上进行。本研究设计的针对8对引物的PCR反应条件为：95℃预变性5min；30个PCR循环中,94℃C变性30sec,59℃退火30sec,72℃延伸1min；最后在72℃延伸10min。4.PCR产物电泳和测序PCR扩增产物5μ1与1μl上样缓冲液混匀,在溴乙锭染色(EB)的1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析,电压80V,时间20分钟,以鉴定PCR扩增的特异性。符合测序条件的PCR产物送测,PCR产物纯化及测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。利用Chromas及Blast等生物软件对测序结果进行分析。结果与讨论1.结果通过Chromas软件在Blast上将测序结果与正常序列进行比对,31例HB患者通过DNA直接测序均检测到了突变位点。查阅相关文献及突变数据库资料,分析检测结果显示,本研究的31例样本中FIX基因的突变位点分散无热点区,突变类型多样,有点突变、插入和缺失等。突变中多数为点突变,在缺失突变中有1例全基因缺失,其他均为小片段缺失。31例患者共发现了34种突变,其中1例为三重突变,6例为双重突变,此外还发现13种新突变,为国际上首次报道。2.讨论到目前为止,FIX基因及其蛋白结构和功能已研究得非常清楚[17]。FIX基因定位于Xq27.1,基因全长约33.5kb,由8个外显子、7个内含子及其侧翼序列中的调控区所组成。HB基因突变类型种类繁多,以点突变、短片段的缺失(少于30bp)和插入突变多见,其中80%左右为单个椷基的突变[18]。不同于HA, HB的散发率可达30%-50%。1990年首次建立了HB突变数据库。随着病例数目的积累,新的缺陷正不断地被发现。从已报道的突变分布看,包括polyA信号区域在内的FIX基因所有区域均有突变发生,且突变具有明显的异质性。整体上,本研究共发现的31例患者除外6例为缺失突变(1例全基因缺失和5例短片段缺失),其余均为点突变,占80.6%,说明了点突变是最常见的突变类型。其次,HB突变数据库显示突变在8个外显子的分布情况也不同。由于编码与Ca2+结合的EGF区及催化区,外显子4和8的突变发生率较高[19]。本研究虽只有31例患者,一共有11例发生于外显子4和8,占35.5%。而外显子1、6、7中突变较少,占16.1%。CpG双核苷酸区域被认为是突变热点,刘敬忠[20、21]等采用PCR法和GAWTS技术也进一步证实了CpG确系突变热点,主要是C→T/A。本研究中有7例发生在CpG热点上,类型为C→T, G→A和G→T,占22.6%,又一次证明了CpG双核苷酸的突变热点区域。Toyozumi[22]等确定了内含子1的第192核苷酸(FIX192)为二核苷酸多态性位点,存在于正常日本人中。王宁遂[23]等发现并计算出中国人FIX-192A和G的基因频率分别为0.81和0.19。本研究中发现有4例患者在此处发生突变,进一步验证了该基因此位置的多态性位点。与此同时,其中2例HB患者所有外显子及剪切部位只发现了此处惟一的突变点即多态性位点,患者本身确诊为HB,有理由怀疑其致病突变为在未测序范围的内含子区域。因此,需要另外扩增覆盖7个内含子大片段区域和3’不翻译区域的序列,进行DNA测序以确定基因突变位置。经过最新HB突变数据库查询,本研究共发现13种新突变,为国际上首次报道。其中4种为发生在外显子的错义突变,氨基酸改变分别为L-Q、Y-D、S-P和V-G。氨基酸改变导致编码的蛋白质结构改变从而引起蛋白质功能的降低或缺失,引起凝血功能的障碍,导致了血友病的发生。缺失类型方面,除-T为已报道的导致阅读框架移改变的缺失突变外,其余3种·均为新发现的缺失类型,其中-GCTGAAACCA和-GCTAAACA为发生在外显子部位引起阅读框架改变的缺失突变,-ATTT为剪接位点缺失。剪切位点是外显子与外显子衔接重要部位,此位置的基因改变会导致衔接过程受阻,引起无法正常剪切或剪切改变,最终引起蛋白质结构跟功能异常,导致凝血障碍。此外,T6320A、C6828T、G6640A、 A29753G、G30321T和T17517G等6种碱基突变发生于外显子以外的序列位置。比对内含子／外显子剪接碱基序列,已知6320碱基属于剪切位置,可确定T6320A为引起剪接改变的致病突变。其余5种突变不在剪切位置,是否为一种新的多态性或者为致病突变,则需要进一步的研究。相对于HA, HB较为少见,人群发病率只有1/30000。而我国是发展中国家,人们对疾病的认识相较于发达国家有很大的差距,HB患者无法得到确诊和救治,就医患者数目极少。国内关于HB的研究机构及人员也属于少数群体,关于中国人HB的相关文献报道相当有限。虽然国际上已经建立了HB突变数据库,但是包含的病例数也只有几千例,而HB的基因突变呈现多样性,且HB散发率也高。鉴于HB有限的研究资源,本研究通过对31例HB患者FIX基因进行的基因突变分析,对携带者基因突变筛查及产前基因诊断具有指导意义。而FIX基因的新突变的发现,在丰富突变谱同时,不仅有助于进一步了解FIX基因中某些氨基酸残基对于FIX凝血活性的重要性,明确致病机制,也为以后的基因治疗提供了科学依据。结论1.CpG双核苷酸区域是突变热点。2.我国人群中,内含子1的第192核苷酸(FIX192)为二核苷酸多态性位点。3.发生在外显子区域的点突变、缺失和插入等导致氨基酸改变或提前终止可确定为致病突变。剪接位置的突变也确定为致病突变。4.除去多态性位点突变外无其他基因突变的病例,需要进行除外外显子序列的测序寻找致病突变位点。发生在内含子的基因突变需要进一步鉴别是否为致病突变,或为多态性位点,也需要进行除外外显子序列的基因测序。