第一章miRNA与卵巢上皮癌耐药研究进展（综述）卵巢上皮癌是在全世界妇女中致死率第五位的最常见的妇科恶性肿瘤。手术及以紫杉醇和顺铂为主的化疗是治疗卵巢上皮癌重要手段之一,但多药耐药的产生又是导致化疗失败的关键因素。因此,了解化疗耐药产生的机制对于提高治疗效果至关重要。卵巢上皮癌多药耐药与多种因素有关,本章节就miRNA与卵巢上皮癌多药耐药机制进行综述。第二章miRNA对卵巢上皮癌多药耐药相关的生物信息学分析1.研究目的：基于表达谱芯片数据分析和生物信息学手段挖掘与卵巢癌上皮耐药调控相关的潜在miRNAs和基因。2.研究方法：在Gene Expression Omnibus （GEO）数据库中下载与卵巢癌耐药相关的miRNA表达谱芯片数据GS54665和mRNA表达谱芯片数据GSE33482, GSE28646, GSE15372,并利用GEO2R工具进行差异分析和筛选,并通过实时定量PCR对其获得的部分基因在卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP和A2780/DDP及其亲本细胞中进行验证。通过通路富集、生物学过程注释、文本挖掘、蛋白互作及miRNA-mRNA互作等综合生物信息学方法研究差异表达miRNAs和基因与卵巢癌耐药调控的相关性。3.研究结果：3.1在GEO数据库获得了符合标准的与卵巢癌耐药相关的1组miRNA表达谱芯片数据和3组mRNA表达谱芯片数据,获得了在耐药细胞中差异表达的9个miRNAs和在三组芯片耐药细胞中均差异表达的38个基因,其中7个差异表达基因在三组芯片中趋势完全一致。3.29个miRNAs的通路富集获得了Focal adhesion、PI3K-Akt signaling pathway、ErbB signaling pathway, MAPK signaling pathway等多个与卵巢癌耐药相关的信号通路有关,而生物学过程注释和通路富集表明上述38个基因与细胞因子-细胞因子受体作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）通路,细胞黏附及免疫调节等卵巢癌耐药生物学过程显著相关3.3 miRNA-mRNA互作分析表明9个miRNAs与38个基因中的大多数成员存在靶向调控关系,从而从整体上说明本研究中筛选的差异表达miRNAs和基因与卵巢癌耐药调控的相关性。3.4我们通过QRT-PCR对9个差异表达的miRNAs和7个差异表达基因（NHSL1, EPHA3, SNCA, USP51和ZSCAN4, EPHA7和P115）进行了表达检测发现,几乎所有差异表达的miRNA在SKOV3（SKOV3/DDP）及A2780（A2780/DDP）细胞中的表达趋势与芯片数据一致。7个差异表达的基因中,除了SNCA外,在A2780 （A2780/DDP）细胞的表达趋势与芯片结果一致。3.5 miR-141属于miR-200家族成员之一,EPHA7和P115为其潜在靶基因,它们在表达水平上呈负相关。4.结论：4.1通过对芯片数据分析,筛选出9个miRNA及38个mRNA与卵巢癌耐药有关,其中7个mRNA在所有芯片结果中表达趋势一致。4.2 EPHA7和PI15为差异表达miRNA-141的潜在靶基因,且它们在表达水平上呈负相关,可能共同参与卵巢癌耐药,是卵巢癌靶向治疗的潜在靶标第三章卵巢上皮癌多药耐药相关lncRNA表达谱分析及与miRNA相关的ceRNA筛选化疗是晚期卵巢上皮癌的首选治疗方法,但是耐药的产生是妨碍化疗长期有效的一个重要的因素。近年来,人们把研究的目光投向了长链非编码RNA（long noncoding RNA, LncRNA）。长链非编码RNA是一类由RNA聚合酶II转录形成,转录本长度超过200nt的RNA分子,通常具有polyA尾,广泛分布于哺乳动物体内。由于缺少“开放阅读框架”,lncRNA不编码蛋白,其可在表观遗传学,转录水平和转录后水平等多个层面调控基因表达。但是现在与耐药相关的lncRNA及与miRNA存在ceRNA调控的lncRNA还鲜有报道。1.研究目的：对卵巢癌多药耐药相关lncRNA和基因进行表达谱分析,初步得到卵巢癌多药耐药相关lncRNA及基因,为阐明卵巢癌耐药机制和获得具有克服耐药潜能的靶分子打下基础。2.研究方法：2.1.通过lncRNA芯片对卵巢癌上皮癌耐药组织标本5例及敏感组织各5例进行lncRNA表达谱分析,同时分析差异表达的mRNA,找到在耐药细胞中差异表达的lncRNA;2.2.对差异表达的lncRNA采用Pearson相关分析进行共表达基因分析、然后利用超几何累积分布函数（Hypergeometric cumulative distribution function）按FDR<0.01,P<0.05,对编码基因的进行功能注释。2.3通过ceRNA_score原理进行ceRNA分析,并通过调控的mRNA进行GO、KEGG功能注释；并筛选与miR-200家族相关的ceRNA。2.4通过对差异表达的lncRNAs,搜索其上下游300k范围内的所有编码基因,并与该lncRNAs有显著共表达的基因取交集进行cis调控分析,按照相关系数p<0.01,至少3个以上相邻基因,筛选出lncRNA相邻的基因。2.5根据lncRNAs共表达的编码基因集合与转录因子／染色质调控复合物的靶基因集合的交集,利用超几何分布计算该交集的富集程度,得到与lncRNAs显著相关的转录因子。3.研究结果：3.1根据差异表达的标准：Fold change值≥2.0且p≤0.05,耐药组和对敏感组相比,有738个lncRNAs表达有差异,其中上调311个,下调427个,其中NONHSAT076042 （Fold change:8.95）是上调倍数最大的lncRNA, TCONS₁2₀0021133 （Fold change:7.29）是下调倍数最大的lncRNA;同时检测到有983个mRNAs表达有差异,其中上调678个,下调308个,其中SFRP2 （Fold change:28.48）是上调倍数最大的mRNA, LDLRAD1 （Foldchange:16.44）是下调倍数最大的mRNA。3.2采用Pearson相关分析,按照LncRNAs与mRNAs表达值的相关系数（Correlation）>0.7, p<0.05对差异表达lncRNA进行共表达基因分析,选出上调、下调lncRNA各top300,然后分别进行功能富集,筛选出预测到的功能terms top500,结果显示上调表达的lncRNA主要与白细胞迁移、细胞外基质、DNA包装、细胞黏附通路、ECM-受体通路等有关（p<0.05）；下调表达的lncRNA主要细胞外基质组成、细胞骨架、DNA包装、细胞黏附通路、ECM-受体通路等有关（p<0.05）。3.3通过ceRNA分析,得到25个可以作为ceRNA的lncRNA,一共是335个ceRNA关系对,其中,我们也发现有5个lncRNA可以作为miR-200家族相关的ceRNA,形成ceRNA调控关系对13个。参与ceRNA调控的lncRNA主要参与的生物学过程及KEGG通路有：细胞黏附、NF-kappaB负调控、间质细胞的增殖、凋亡、Ras信号通路、ErbB信号通路等。3.4 cis调控分析显示有64个lncRNA的相邻基与其共表达基因存在交集。3.5通过trans分析,识别lncRNAs的靶基因以及辅助其进行靶基因转录调控的转录因子,筛选出E2F4、CTCF等29个转录因子构成lncRNAs-TF-targets调控网络。在这个调控网络中,所述的靶基因与lncRNA显著共表达,而且是转录因子的靶基因。4结论：4.1.通过分析卵巢上皮癌耐药组织和敏感的lncRNA和mRNA表达谱特征我们获得了大量差异表达的lncRNA及mRNA,为我们进行卵巢上皮癌多药耐药机制研究提供了很好的资源4.2.与卵巢上皮癌耐药有关的lncRNA可能是通过cis调控相邻的基因、trans调控的转录因子作用于靶基因,或通过ceRNA调控miRNA,或者通过参与和调控多种信号通路和生物学过程参与卵巢上皮癌耐药。4.35个lncRNA （NONHSAT059750、NONHSAT129265、 NONHSAT128169、ENST00000529924、TCONS₁2₀0003421）与miR.-429及其靶基因构成ceRNA调控网络。第四章miR-429对卵巢上皮性癌SKOV3/DDP细胞的生物学功能的体外研究1.研究目的：卵巢上皮癌是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤,耐药的产生是肿瘤治疗过程中最严重的问题之一。肿瘤耐药与多种因素有关,miRNA可能与耐药密切相关。miR-429属于miR-200家族,miR-200家族与多种肿瘤耐药有关。本章我们将通过体外实验验证miR-429对卵巢癌SKOV3/DDP细胞生物学功能的影响。2.研究方法：我们利用慢病毒表达载体成功构建稳定上调miR-429的EOC细胞模型,QRT-PCR检测miR-429的表达水平,CCK8法检测IC50、生长曲线和平板集落形成实验检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞凋亡,采用WB检测miR-429对自噬相关蛋白的影响。3.研究结果：3.1与亲本细胞SKOV3相比,miR-429在耐药细胞SKOV3/DDP中下调表达,卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对化疗药物顺铂的IC50约为亲本细胞的2.5倍。3.2在SKOV3/DDP中转染了LV-miR-429过表达病毒,miR-429的表达量较SKOV3/DDP及LV-miR-NC组,明显升高（P<0.05）。过表达miR-429后,SKOV3/DDP对顺铂的IC50明显下降（P<0.05）。3.3 CCK8增殖结果：转染了miR-429的SKOV3/DDP细胞组的生长速度从第48h开始较miR-NC组、空白对照组的细胞降低,差别有统计学意义（P<0.05）；转染了miR-429的SKOV3/DDP细胞,克隆形成能力明显下降（P<0.05）。3.4 FCM检测细胞凋亡实验结果：miR-429组SKOV3/DDP细胞的凋亡率较另两组细胞明显升高（P<0.05）；3.5在SKOV3/DDP中转染了LV-miR-429过表达病毒后,Atg-7及LC3A/B的表达量明显下降。4结论：4.1 miR-429可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,抑制细胞增殖、促进凋亡；4.2过表达miR-429可能可以通过抑制自噬通路而增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。第五章miR-429的靶基因验证及双荧光素酶报告系统验证靶基因ZEB1（NM₀30751）结合位点1.研究目的：卵巢上皮癌（epithelial ovarian cancer, EOC）,女性生殖系统常见的肿瘤之一,病死率高居妇科恶性肿瘤之首,晚期患者的5年生存率仅约30%。目前,虽然约80%的晚期患者初期治疗有效,但大部分患者最终会出现化疗耐药导致疾病复发。大量研究表明miRNAs可以通过调控靶基因的表达参与信号通路,形成一个复杂而又庞大的调控网络,从而影响肿瘤的发生、发展及参与肿瘤耐药的产生。前期研究结果表明,上调miR-429的表达可以促进SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,本章对miR-429的靶基因及其结合位点进行验证。2.研究方法：本研究通过miR-429的过表达病毒及miR-Negative Control（miR-NC）,来转染卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP将SKOV3/DDP细胞分为miR-429组、miR-NC组及空白对照组,用生物信息学技术如miRBase、TargetScan等数据库预测其作用靶点,再通过Western Blot技术检测转染后细胞的靶蛋白的表达量来验证miR-429的靶基因。最后通过双荧光素酶报告系统验证ZEB1上存在miR-429的作用靶点。3.研究结果：3.1 miR-429的作用靶点的预测及验证：经过检索数据库,选择ZEB1等5个基因为其候选靶基因,Western Blot检测发现miR-429组中ZEB1蛋白的表达量较另两组降低（p<0.05）。3.2荧光素酶报告系统显示ZEB1为miR-429靶基因,而且可能主要由第一位点起作用。4结论：4.1 miR-429可以靶向作用于ZEB1,过表达miR-429对ZEB1基因的表达有抑制作用。4.2 miR-429对ZEB1的调控主要可能依赖于与第一处预测位点区域中（Position 369-376）的碱基对结合发挥作用。