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缺氧是实体瘤中普遍存在的现象,可以诱发肿瘤细胞对化疗药物的抵抗,是实体瘤患者化疗失败最重要的原因之一。缺氧诱导肿瘤细胞耐药是一个非常复杂的过程,有多种分子的参与,尽管目前对缺氧诱导耐药的研究已进行多年,但仍未发现行之有效的逆转方法。这是由于其分子机制仍未完全阐明,更重要的是未能找到诸多耐药相关基因的上游调控分子。因此,阐明其分子机制并寻找从缺氧发生到出现耐药表型形成过程中的关键分子,将其作为靶点来逆转实体瘤耐药,将为治疗肿瘤开辟新的道路。近年来,有研究报道提示缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)可能是缺氧诱导实体瘤多药耐药的一个关键分子。因此,深入探讨HIF-1在缺氧诱导胃癌多药耐药中的作用及其分子机制,将有助于全面深入地理解缺氧诱导胃癌MDR发生的过程和调节机制。目的:研究缺氧条件下胃癌细胞对于多种化疗药物的耐受性,检测缺氧条件下胃癌细胞中HIF-1的表达以及缺氧诱导HIF-1的上游信号通路;构建HIF-1表达上调和下调的胃癌细胞亚系,研究HIF-1在缺氧诱导胃癌MDR中的作用;并进一步探讨HIF-1转录调控的下游的耐药相关分子的表达和调控机制,进一步明确HIF-1在缺氧诱导肿瘤细胞耐药中的作用机制;以HIF-1为靶点进行体内药物逆转实验,为HIF-1作为逆转缺氧条件下实体瘤MDR的增敏剂提供实验依据。方法:1.通过MTT比色法、Annexin V/PI染色法和阿霉素潴留和蓄积试验检测缺氧和常氧状态下胃癌细胞对于不同化疗药物的药物敏感性;2.利用Western blot和双荧光素酶报告基因系统检测缺氧诱导胃癌细胞HIF-1的蛋白表达和转录活性;3.利用半定量RT-PCR和ELISA方法检测缺氧诱导下的VEGF的mRNA和蛋白表达;4.利用Western blot和双荧光素酶报告基因系统检测缺氧条件下磷酸化AKT、p42/44 MAPK(ERK1/2)水平,以及使用PI3K特异性抑制剂LY294002(5、10μM)和MEK特异性抑制剂U0126 (1、10μM)后其下游激酶AKT和p42/44 MAPK(ERK1/2)的磷酸化水平的变化以及HIF-1表达和转录活性的变化;5.利用半定量RT-PCR、ELISA和双荧光素酶报告基因系统检测缺氧条件下使用PI3K特异性抑制剂LY294002(5、10μM)和MEK特异性抑制剂U0126 (1、10μM)后VEGF的mRNA、蛋白表达以及EPO的荧光素酶活性;6.通过MTT比色法检测HIF-1上调和HIF-1下调的胃癌细胞在常氧和缺氧条件下对于不同化疗药物的敏感性;通过Annexin V/PI染色法检测HIF-1上调和HIF-1下调的胃癌细胞系对于化疗药物诱导的凋亡的影响,并计算凋亡指数;借助流式细胞仪(FCM)检测HIF-1上调和HIF-1下调的胃癌细胞系内阿霉素的蓄积和潴留,并计算相应的药物泵出率; 7.利用RT-PCR和Western blot方法检测缺氧条件下以及转染HIF-1正义表达载体和小干扰RNA载体的细胞中MDR1、MRP1、Bcl-2、Bax和MGr1-Ag的表达水平;8.利用双荧光素酶报告基因系统、染色质免疫共沉淀、电泳迁移率试验检测HIF-1对MGr1-Ag转录调控机制;9.通过细胞黏附实验、MTT比色法和Annexin V/PI染色法检测转染MGr1-Ag siRNA的胃癌细胞在缺氧条件下的细胞黏附状态以及对于不同化疗的药物敏感性及凋亡指数的变化;10.通过构建人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的裸鼠移植瘤模型,观察以HIF-1为靶点的小干扰RNA对于SGC7901/VCR耐药性的体内逆转效果;通过免疫组织化学的方法,检测各处理组移植瘤内HIF-1的表达水平。通过Western Blot检测各处理组移植瘤内HIF-1的蛋白表达。结果:1.与常氧状态细胞相比,缺氧能够降低胃癌细胞对于不同化疗药物的敏感性,减少化疗药物诱导的凋亡和细胞内阿霉素的蓄积和潴留(p<0.05);2.缺氧能够诱导不同胃癌细胞系HIF-1的蛋白和转录活性,且呈时间依赖性的增加。缺氧还能够诱导不同的胃癌细胞系中HIF-1的下游靶基因VEGF的mRNA和蛋白水平以及EPO的荧光素酶活性;3.缺氧能够诱导胃癌细胞系中磷酸化AKT、p42/44MAPK(ERK1/2)的表达;4. PI3K和MEK的抑制剂LY294002和U0126能够抑制缺氧诱导的磷酸化AKT和ERK1/2表达,进而抑制了HIF-1的表达和活性;5. LY294002和U0126抑制缺氧诱导的VEGF的mRNA和蛋白水平以及EPO的荧光素酶活性; 6.与对照细胞相比,转染正义HIF-1表达载体的胃癌细胞对于不同化疗药物的敏感性明显降低,化疗药物诱导的凋亡指数明显减少,转染细胞内Bcl-2的表达显著增强,Bax表达显著减弱;细胞内阿霉素的蓄积和潴留均明显减少,细胞内P-gp、MRP的表达明显增加(p<0.05)。转染HIF-1siRNA细胞能够明显逆转缺氧诱导的化疗药物的抵抗,化疗药物诱导的凋亡指数明显增加,Bcl-2的表达显著减弱,Bax表达显著增强,细胞内阿霉素的蓄积和潴留均明显增加,细胞内P-gp、MRP的表达明显降低(p<0.05);7.缺氧能够上调MGr1-Ag的表达,抑制HIF-1的表达能够明显抑制缺氧诱导的MGr1-Ag的mRNA和蛋白水平;8.在MGr1-Ag启动子区域的转录起始位点的上游-16的区域有HIF-1的缺氧反应元件的结合序列5’-ACGTG-3’,HIF-1能够与该元件结合从而发挥其转录调控的功能;9.缺氧能够显著增强胃癌细胞黏附与基质的能力,而转染了MGr1-Ag siRNA的胃癌细胞的黏附能力显著下降。与对照细胞相比,转染了MGr1-Ag siRNA的胃癌细胞能够逆转缺氧所致的化疗药物耐受和增加化疗药物诱导的凋亡。10.与各种对照组相比,以HIF-1为靶点的小干扰RNA可以明显增强人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的裸鼠移植瘤对于长春新碱的敏感性,移植瘤体积显著减小(p<0.05),移植瘤组织内HIF-1的表达下降,Western Blot结果显示,移植瘤内HIF-1表达水平明显下调(p<0.05)。结论:1.缺氧能够显著降低化疗药物的敏感性;2.胃癌细胞在缺氧条件下,通过活化PI3K/AKT和MEK-p42/44MAPK(ERK1/2)信号通路途径介导了HIF-1的稳定表达和转录活化,并进而增强了对于化疗药物的耐受性;3.缺氧诱导的HIF-1依赖性MDR是通过上调Bcl-2和下调Bax降低化疗药物诱导的凋亡,以及通过上调p-gp和MRP的表达而减少了化疗药物在细胞内的潴留和蓄积来实现的;4. HIF-1还通过诱导胃癌耐药相关新分子MGr1-Ag的表达来介导胃癌细胞在缺氧条件下的黏附介导的多药耐药。5.以HIF-1小干扰RNA作为增敏剂可以显著增强长春新碱对人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的裸鼠移植瘤的化疗效果。