多发性硬化症(Multiple Sclerosis，MS)是经典的中枢神经系统(centralnervous system，CNS)自身免疫性脱髓鞘疾病。由于对MS的发病机制了解有限，并且缺乏敏感的生物学标记物，此病早期有效的诊断和治疗十分困难。　　 目前认为，MS的发病主要是由于T细胞对自身的髓鞘蛋白产生了自身免疫反应，并导致一系列复杂的神经退行性改变。其中，CD4+T辅助细胞(T helper cells，Th cells)介导的自身免疫反应是MS发病最关键的因素。Th细胞在不同的条件下可以分化为不同种类的T细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17以及Treg等。其中，Th17是被发现的新型Th细胞亚群，以能够分泌IL-17为主要特点。目前认为Th17细胞在MS的病理发生过程中发挥重要作用。研究表明，MS患者外周血Th17细胞比例明显高于健康对照。此外，MS患者IL-23受体及RORc（调节Th17分化的关键细胞因子受体和转录因子）的表达水平也高于健康对照。在MS的动物模型实验性变态反应性/自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Allergic/AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)中发现，IL-17中和抗体，可以延缓EAE所致的神经功能障碍的发生;Th17细胞缺失或Th17细胞数目的减少可以使小鼠对EAE的敏感性下降。因此，调控Th17细胞的分化和IL-17的分泌是治疗EAE的关键点之一。虽然现有研究从细胞因子、受体及信号通路、转录因子层面对Th17极化机制有一定程度的了解，但是，表观遗传学修饰在Th17分化和EAE中的作用，目前还知之甚少。　　 小RNA(microRNA，miRNA)介导的转录后基因调控是表观遗传学修饰的重要机制之一。microRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的非编码RNA，在许多人类疾病中发挥重要调节的作用，有可能作为诊断、预后生物学标记物和疾病的治疗靶标。我们通过microRNA的靶基因预测软件，挑选出106条可能调控Th17分化的microRNA，并结合已有的microRNA在自身免疫性疾病病灶中表达数据分析，我们将重点研究miR-30a在MS发生中的作用。　　 我们将探讨miR-30a在MS患者和EAE小鼠外周血单个核细胞中的表达模式，miR-30a对EAE的治疗作用以及miR-30a调控Th17细胞分化的可能机制。以期为MS的诊断和治疗提供新的分子靶点，也为Th17细胞分化的表观遗传调控提供新的分子机制。在本研究中，我们首先采集了复发缓解型MS患者复发期和缓解期的外周血，分离外周血单个核细胞，检测了miR-30a的表达;然后分离EAE小鼠的外周血单个核细胞，研究了miR-30a表达与IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17表达的相关性;进一步，我们通过给动物注射髓鞘相关糖蛋白片段诱导其 CNS脱髓鞘，建立了稳定的MS的动物模型，并通过尾静脉注射miR-30a的慢病毒，检测miR-30a对EAE的治疗作用;最后，我们构建了SOCS1和IRF4的3非编码区野生型和突变质粒，采用荧光素酶双报告系统研究了miR-30a与靶基因SOCS1和IRF4的3UTR区的结合。主要研究结果如下:　　 1、针对收集得到的8例MS患者和4例正常健康对照者的血液，我们采用EDTA抗凝，淋巴细胞分离液密度梯度离心法得到外周血单个核细胞，进一步用流式细胞分选的方法收集得到了CD4+T细胞，细胞存活率和纯度均大于99％。　　 2、将采集的到的外周血单个核细胞，采用Real-time PCR检测miRNA-30a表达水平的变化。发现在MS复发期和缓解期miR-30a的表达较对照组均明显下调，具有显著的统计学差异。缓解期中miR-30a的表达略高于复发期，但无显著的统计学差异。　　 3、我们通过给动物注射髓鞘相关糖蛋白片段MOG35-55诱导EAE，发现小鼠从免疫第11天开始陆续发病，潜伏期为12.95±2.5天，发病率为93.3％。死亡率为6.67％。发病后小鼠一般情况较正常组差，表现为精神萎靡，体重减轻或增长缓慢，皮毛不光滑，活动量减少，并出现明显的神经系统症状。　　 4、我们分别于免疫后第10、16天，即EAE发病前期和EAE急性进展期，分离小鼠脾脏中CD4+T细胞，检测其miR-30a表达水平改变。结果显示，EAE发病前期，小鼠脾脏CD4+T细胞中miR-30a的表达水平明显低于对照组。EAE小鼠急性进展期CD4+T细胞的比例及CD4+T细胞内miR-30a的表达水平均明显低于对照组。　　 5、为了研究miR-30a主要通过哪一种CD4+T细胞发挥作用，我们采用慢性非缓解性EAE小鼠动物模型，在EAE急性炎症期，分离小鼠脾脏单个核细胞，检测细胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17a的表达以及miR-30a的表达。结果发现，随着miRNA-30a表达升高，IL-17a的表达是下降的，两者之间的表达水平呈显著负相关。细胞因子IFN-γ、IL-4和TGF-β的表达无显著线性关系。　　 6、为了研究miR-30a是否对小鼠EAE发病具有调控作用，我们构建并包装了高滴度的miR-30a过表达病毒，尾静脉注射病毒到EAE小鼠体内。结果发现，miR-30a过表达病毒注射组的EAE评分相对于对照组发病明显减轻，差异具有显著性。　　 7、我们进一步检测miR-30a过表达病毒注射对EAE小鼠脊髓的病理改变的影响，通过Fast Blue和HE染色，分别观察脊髓的脱髓鞘和炎症浸润程度。结果发现，miR-30a过表达病毒注射组小鼠脊髓脱髓鞘和炎细胞浸润明显轻于对照组，统计分析显示，结果相差显著。　　 8、我们采用microRNA靶基因预测软件Targetsan和Starbase对miR-30a的靶基因进行预测。结果发现，miR-30a的种子序列(ACAAAUG)可以和Th17分化相关重要转录因子SOCS1和IRF4的3非编码区碱基序列不完全互补配对。　　 9、我们进一步将靶基因SOCS1和IRF4的3非编码区克隆到荧光素酶报告基因上游，并设计3非编码区的突变体，克隆到荧光素酶报告质粒中，与miR-30a共转染293T细胞，加入荧光素酶底物，检测荧光强度。结果发现，miR-30a和含SOCS1、IRF43非编码区的荧光素酶报告质粒共转染组，荧光强度明显低于miR-30a阴性对照与含SOCS1、IRF43非编码区的荧光素酶报告质粒共转染组，统计分析具有显著性差异。但是，miR-30a和含SOCS1、IRF43非编码区突变体的荧光素酶报告质粒共转染组，荧光强度与对照组没有显著差异。　　 本研究的重要结论如下:　　 1、 MS患者外周血单个核细胞中miR-30a的表达水平较健康对照组明显下降。EAE发病潜伏期和急性发病期，小鼠CD4+T细胞中miR-30a的表达水平较健康对照组均明显下降。　　 2、 EAE急性发病期，miR-30a与炎性细胞因子IL-17a的表达呈负相关。　　 3、 EAE小鼠在体给予miR-30a后，可以明显缓解EAE的发病，表现为行为学评分明显下降，脱髓鞘程度明显减轻，炎细胞浸润明显减少。　　 4、 miR-30a直接与Th17分化相关转录因子SOCS1和IRF4的3非编码区结合，沉默其基因表达，提示miR-30a可能通过此机制抑制Th17分化和EAE的进展。