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背景:肺纤维化是一种慢性、进行性和不可逆的纤维化性间质性肺疾病。临床上主要表现为进行性呼吸困难,并伴有肺功能的下降。病理学上,肺纤维化主要以上皮细胞受损,成纤维细胞激活和细胞外基质异常沉积为特征。肺纤维化包括特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)和继发因素所致的肺纤维化,临床上以IPF最为常见,且治疗最为棘手。IPF是一种致死性肺疾病,其自然病程各异,大多数患者发病后的平均生存时间为2-4年。肺纤维化的发病机制尚不清楚,目前学术界一致认为是多重因素参与的结果,其中上皮-间质转化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)学说占据了重要的地位。微小RNA(Micro RNA,miRNA/miR)是一类长度为18-22个核苷酸,不能编码蛋白的单链RNA分子,在EMT的发生过程中起到了重要的作用。miRNA通过负向调控靶基因的转录和翻译,从而参与细胞生物学活动以及疾病的发生发展。目前,miR-483-5p的研究主要集中于肿瘤中,但其在肺纤维化中的作用及可能的分子机制尚不明确。目的:本研究通过探讨miR-483-5p在肺纤维化中的表达,具有的生物学功能以及参与调控肺纤维化的潜在机制,以期为临床上早期诊断、早期治疗以及未来开发靶向miRNA药物用于治疗肺纤维化提供一定的实验基础和理论依据。方法:(1)生物信息学分析:通过对GEO公共数据库挖掘筛选到目标研究分子miR-483-5p;对数据库中人肺纤维化组织和人正常肺组织中miR-483-5p和其可能的靶基因Rho鸟苷酸解离抑制因子1(Rho GDP dissociation inhibitor 1,RhoGDI1)的表达水平进行分析,以探索在人肺纤维化组织和人正常肺组织中二者是否存在表达差异。(2)人体肺组织标本:收集人肺纤维化组织和人正常肺组织标本,采用q PCR检测miR-483-5p和RhoGDI1的表达水平,从临床样本角度出发验证二者是否存在表达差异。(3)细胞实验:采用转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)(10 ng/ml)刺激人肺泡上皮细胞(A549)和人支气管上皮细胞(BEAS-2B)48 h,构建上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)细胞模型,用q PCR检测miR-483-5p和RhoGDI1的表达。采用miR-483-5p mimic或miR-483-5p inhibitor联合TGF-β1干预A549和BEAS-2B细胞,用q PCR、Western blot、ELISA和免疫荧光检测上皮细胞标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)以及间质细胞标记物波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。采用miR-483-5p mimic或miR-483-5p inhibitor转染A549和BEAS-2B细胞,用q PCR和Western blot检测RhoGDI1的表达。采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-483-5p和RhoGDI1是否存在结合位点。在回复实验中,采用q PCR、Western blot和ELISA对E-cadherin、Vimentin和α-SMA的m RNA和蛋白表达进行测定,并采用Western blot对Rac1/PI3K/AKT信号通路中的蛋白进行检测。(4)动物实验:将40只6-8周龄,雄性C57BL/6小鼠,随机分为生理盐水对照组(Ctrl组)、博来霉素模型组(BLM组)、博来霉素+antagomir NC组(BLM+antagomir NC组)和博来霉素+miR-483-5p antagomir组(BLM+miR-483-5p antagomir组),每组10只小鼠。在给予小鼠气管内注入5 mg/kg的博来霉素构建肺纤维化模型时,BLM+antagomir NC组和BLM+miR-483-5p antagomir组同时经气管分别给予5 nmol的antagomir NC和miR-483-5p antagomir,然后于实验的第7、14和21天经小鼠尾静脉分别给予3 nmol的antagomir NC和miR-483-5p antagomir。于实验造模后的第28天,处死所有组中小鼠,收集肺组织。采用HE染色观察小鼠肺组织的病理改变并行Ashcroft评分,采用Masson染色检测小鼠肺组织内胶原沉积情况。采用q PCR检测小鼠肺组织内miR-483-5p的表达。采用Western blot检测小鼠肺组织内RhoGDI1的表达。采用碱性水解法检测小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量。采用q PCR、Western blot和免疫组化检测小鼠肺组织中EMT的标记物(E-cadherin、Vimentin和α-SMA)和I型胶原的表达情况。采用Western blot检测小鼠肺组织中Rac1/PI3K/AKT信号通路中相关蛋白的表达。结果:(1)生物信息学分析:通过对GSE27430非编码RNA数据集的分析发现:与人正常肺组织相比,人肺纤维化组织中miR-483-5p表达上调;在GSE110147基因数据集中分析发现,与人正常肺组织相比,人肺纤维化组织中RhoGDI1表达下调。上述结果提示miR-483-5p和RhoGDI1在人肺纤维化组织和人正常肺组织中可能存在表达差异。(2)临床样本分析:通过收集和分析临床样本,我们证实:与人正常肺组织相比,人肺纤维化组织中miR-483-5p表达升高,而RhoGDI1表达降低。上述结果提示miR-483-5p和RhoGDI1在人肺纤维化组织和人正常肺组织中存在表达差异,进一步佐证了前述生物信息学分析的结果;miR-483-5p和RhoGDI1可能参与了肺纤维化的发生发展。(3)细胞实验:(1)TGF-β1诱导上皮细胞发生EMT的过程中,miR-483-5p与RhoGDI1的表达水平发生变化:与对照组相比,TGF-β1刺激A549和BEAS-2B细胞后,miR-483-5p表达上调,而RhoGDI1表达下调,提示miR-483-5p和RhoGDI1可能参与了EMT的发生。(2)miR-483-5p促进TGF-β1诱导上皮细胞发生EMT:在A549和BEAS-2B细胞功能验证实验中,与对照组相比,TGF-β1组中E-cadherin表达下调,而Vimentin和α-SMA表达上调。与TGF-β1+mimic NC组相比,TGF-β1+miR-483-5p mimic组中E-cadherin表达下调,Vimentin和α-SMA表达上调。相反,与TGF-β1+inhibitor NC组相比,TGF-β1+miR-483-5p inhibitor组中E-cadherin表达上调,Vimentin和α-SMA表达下调。上述结果表明,TGF-β1可以诱导A549和BEAS-2B细胞发生EMT;过表达miR-483-5p可以促进TGF-β1诱导A549和BEAS-2B细胞发生EMT;而抑制miR-483-5p表达,可抑制TGF-β1诱导A549和BEAS-2B细胞发生EMT。(3)miR-483-5p负向调控RhoGDI1表达:miR-483-5p mimic可以抑制A549和BEAS-2B细胞表达RhoGDI1;而miR-483-5p inhibitor可以促进RhoGDI1的表达。(4)RhoGDI1为miR-483-5p的靶基因:双荧光素酶基因报告实验结果显示miR-483-5p和RhoGDI1存在结合位点,提示RhoGDI1为miR-483-5p的靶基因。(5)敲低RhoGDI1,可逆转miR-483-5p inhibitor抑制TGF-β1诱导的EMT:在A549和BEAS-2B细胞的回复实验中,与TGF-β1+miR-483-5p inhibitor+sh RNA-NC组相比,TGF-β1+miR-483-5p inhibitor+sh RNA-RhoGDI1组中E-cadherin表达降低,而Vimentin和α-SMA表达升高,提示敲低RhoGDI1,可逆转miR-483-5p inhibitor抑制TGF-β1诱导的EMT。(6)miR-483-5p inhibitor通过上调RhoGDI1而抑制Rac1/PI3K/AKT通路,从而抑制TGF-β1诱导的EMT:在A549和BEAS-2B细胞机制探讨实验中,TGF-β1可以激活Rac1/PI3K/AKT通路,继而诱导上皮细胞发生EMT;然而,miR-483-5p inhibitor通过上调RhoGDI1而抑制Rac1/PI3K/AKT通路,从而抑制TGF-β1诱导的EMT。(4)动物实验:(1)小鼠肺纤维化组织中,miR-483-5p和RhoGDI1表达水平分析:与Ctrl组相比,BLM组和BLM+antagomir NC组中小鼠肺组织内miR-483-5p表达升高,RhoGDI1表达降低;与BLM+antagomir NC组相比,BLM+miR-483-5p antagomir组中小鼠肺组织内miR-483-5p表达降低,而RhoGDI1表达升高。上述结果表明,在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化中,miR-483-5p表达上调,其靶基因RhoGDI1表达下调;而加入miR-483-5p antagomir,可使肺组织中miR-483-5p表达下调,其靶基因RhoGDI1表达上调。(2)抑制miR-483-5p表达可减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化:与Ctrl组相比,BLM组和BLM+antagomir NC组中小鼠肺组织肺泡结构破坏,肺泡间隔增厚,胶原纤维产生增多,可见纤维化灶形成以及Ashcroft评分增加;与BLM+antagomir NC组相比,BLM+miR-483-5p antagomir组中肺泡间隔增厚减轻,胶原纤维沉积减少,纤维化灶形成减少以及Ashcroft评分降低。上述结果表明,气管内注入博来霉素可成功构建小鼠肺纤维化模型;抑制miR-483-5p的表达,可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。(3)抑制miR-483-5p表达可抑制EMT以及抑制羟脯氨酸和I型胶原的表达:与Ctrl组相比,BLM组和BLM+antagomir NC组中小鼠肺组织内EMT的标记物E-cadherin表达降低,而Vimentin和α-SMA表达升高,同时羟脯氨酸和I型胶原表达升高;与BLM+antagomir NC组相比,BLM+miR-483-5p antagomir组中小鼠肺组织内E-cadherin表达升高,而Vimentin、α-SMA、羟脯氨酸和I型胶原表达降低。上述结果表明,抑制miR-483-5p表达可以抑制EMT以及抑制羟脯氨酸和I型胶原的表达。(4)抑制miR-483-5p表达可上调RhoGDI1而阻断Rac1/PI3K/AKT通路激活,进而抑制EMT,减轻肺纤维化:与Ctrl组相比,BLM组和BLM+antagomir NC组中小鼠肺组织内Rac1-GTP、p-PI3K和p-AKT表达升高;与BLM+antagomir NC组相比,BLM+miR-483-5p antagomir组中小鼠肺组织内Rac1-GTP、p-PI3K和p-AKT表达降低。上述结果表明,博来霉素通过激活Rac1/PI3K/AKT来诱导EMT发生,从而导致小鼠发生肺纤维化;抑制miR-483-5p表达可上调RhoGDI1而阻断Rac1/PI3K/AKT通路,从而抑制EMT,最后减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。结论:miR-483-5p通过负调控RhoGDI1基因,从而激活Rac1/PI3K/AKT通路,继而促进上皮细胞发生EMT,最终导致肺纤维化发生发展。抑制miR-483-5p表达可在一定程度上减轻肺纤维化。本研究在一定程度上进一步完善和丰富了肺纤维化的发生机制,同时为临床上早期诊断、早期治疗以及未来开发靶向miRNA药物用于治疗肺纤维化提供了相应的实验数据支持和理论依据。