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人线粒体DNA(mtDNA)是存在于线粒体内的双链环状DNA分子,长16,569bp,基因编码产物包括2种rRNA、22种tRNA及13种多肽链。其中多肽链均是氧化磷酸化酶复合体的重要组成成分,而rRNA和tRNA则参与这些多肽链的合成。因此,mtDNA上任何基因的突变,都可能影响线粒体氧化磷酸化的功能,从而造成细胞的某些病理性改变。研究发现,mtDNA受到氧化性损伤后会引起缺失和插入突变以及点突变等。近十年来,已经发现mtDNA缺失突变与衰老以及一些退行性疾病有关。同时,在其它一些疾病如肿瘤、家族性耳聋等,一些mtDNA缺失突变也被检测到。 开展这方面相关的研究,准确全面地检测mtDNA缺失突变十分必要。但目前对于mtDNA缺失突变,检测的准确性、系统性都还没有很好地解决。所以,虽然人们早已注意到mtDNA缺失突变在衰老及多种人类疾病中有重用作用,但到底是什么样的作用,至今仍无定论。甚至有些矛盾的实验数据。我们认为,要明确mtDNA缺失突变在衰老或其它一些病理状态中的意义,首先必须保证实验结果的科学性。对于mtDNA缺失突变的检测来说,就是要保证其准确性和系统性。 本实验主要探讨人mtDNA缺失突变检测准确性和系统性的方法学,在此基础是上,对人mtDNA缺失突变在肿瘤和衰老中的发生情况及意义进行初步的研究。 一.改进了人mtDNA的制备方法 为了建立一种简便、快捷地从人外周血和组织中制备高质量线粒体DNA的方法,本研究以差速离心法分离线粒体,用碱性SDS法裂解线粒体膜,释放线粒体DNA后用酚一氯仿抽提,TE或ddH2O溶解。然后将所得线粒体DNA进行纯度鉴定并和其他现有方法制备的线粒体DNA用PCR进行长片段扩增,比较扩增效果。结果发现用改进的方法制备的线粒体DNA中没有检测到核DNA,并能有效扩增8kb长的目的片段。改进后的方法简便、快捷,制备的线粒体DNA纯度高,也有利于长片段PCR扩增。 二.进一步完善了我们实验室已经建立的“改良PCR法” 我们曾经用改进的PCR的方法从遭受60Co辐照的病人外周血中发现了一种新的889bp的mtDNA缺失突变。在这种改良的方法中,第一次PCR的产物中可疑的第二军医大学硕士论文人线杜体ONA缺失突变检浏的研究带回收后同时用原引物对和内迁引物对扩增,电泳时只有在凝胶上发现两组引物对有相等的(仅相差约20bp)的最长产物带时,我们才认为第一步PCR产物来自于真正的mtDNA缺失。但是,在一种极端的情况下,这种改良的PCR法可能漏掉真正的mtDNA缺失。就是当缺失断点与引物3’端很近(小于10个碱基),甚至紧邻着引物的3’时,尽管第一步PCR产物确实来自于真正的mtDNA缺失,但由于内迁引物对之一没有锚合位点,不可能扩增出与使用原引物对扩增相等的最长产物。所以,我们会将这样的第一次PCR的产物视为“假产物”,即认为它是来自其中一条引物的错配。 正因为存在这样的情况,我们认为当第一次PCR的产物回收后用内迁引物对未能扩增出与使用原引物对相等的最长产物时,马上断定该第一次PCR的产物就是 “假产物”尚且为时过早。为了解决这样的问题,我们用原引物对和外迁引物对(即原引物向外迁10bp)同时扩增原始的mtDNA模板,如果在凝胶上发现两组引物对扩增产物中有相等的(仅相差20bp)的小于最长产物的条带,(一般说来,在凝胶电泳上,外迁引物对扩增的产物比原引物对扩增的产物要淡的多,即PCR产物的量要少得多。这是因为原引物的扩增产物中既有包含缺失断点的真缺失,也有来自其中一条引物的错配的“假产物”。而外迁引物的扩增产物中仅有包含缺失断点的真缺失。)那么这样的第一次PCR的产物就并非是“假产物”,而是包含缺失断点的真缺失。 实验结果证实了我们的假设.我们从培养的SMMC一7721细胞株中检测到一种新的缺失突变。用我们先前建立的改良PCR法会漏掉此突变。缺失片断大小为4857bp,缺失片段为83lont-13166nt之l’ed序列,异常连接处两端有2个5一bp(CTAAC)的直接重复序列。三.建立了系统筛选人mtDNA缺失突变的方法 目前检测mtDNA缺失突变的方法主要有PCR和Southem Bfot。在这方面,PCR具有更多的优点,采用PCR方法,可以快速的检测样品中低水平的缺失突变,而Southem Blot需要检测样品至少2一3 pg,而且需几天才能完成,同时突变比例必须超过5%才能被检测到。因此,PCR方法应用更为普遍。在具体应用PCR方法检测线粒体DNA缺失突变时,主要有以下两种途径:一是在D一fo叩区设计一对引物,用fong PCR技术扩增整个约16.6kb的线粒体DNA分子:二是通过限制PCR条件第二军医人学硕士论丈人线拉体DNA缺失突变检测的研究 (如控制延伸时间,使用普通Taq酶等)来扩增某一区段突变型的线粒体DNA分子,同时,设计多对引物分别检测线粒体DNA不同区段的缺失突变。我们认为,无论是哪一种方法,都存在一定的缺陷。对于long PcR,首先是PcR的条件要求高,扩增时间长,结果也不稳定。而且,对于一些相对小片断的缺失,容易被遗漏;对于上面提到的第二种检测思路,也常常是顾此失彼,难以保证涵盖mtDNA所有的区段。我们综合以往的研究思路和方法,设计了3对引物