第一部分温敏性羟丁基壳聚糖生物安全性研究细胞实验研究目的:针对课题组在国内首次制备具有温敏特性的壳聚糖衍生物-羟丁基壳聚糖(HBC)水凝胶,通过该材料在体外对成纤维细胞及血管内皮细胞生长影响的研究,探讨该材料的细胞学行为,为材料的最终临床应用提供细胞学实验依据。研究方法:1.HBC浸提液对小鼠成纤维细胞(L929)的影响于37℃下将HBC水凝胶浸提于DMEM培养液24小时得浸提液。设置阴性对照组、苯酚阳性对照组及25%、50%、75%、100%浓度浸提液四个实验组,设3块96孔培养板,10孔平行对照组,37℃,5%CO2培养箱内培养。于1天、2天、4天后在倒置显微镜下观察L929细胞生长情况,通过MTS法测定吸光度OD值,计算出不同组细胞的存活率。将L929细胞分别用阴性对照液、50%HBC浸提液及100%HBC浸提液进行培养,3天后用流式细胞学的方法检测L929细胞凋亡情况。2.HBC浸提液对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人肺成纤维细胞(HLF)的影响设25%、50%、75%、100%HBC浸提液4个实验组和阴性对照组,将人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人肺成纤维细胞(HLF)在96孔培养板中培养,每个实验孔内加入100μl待测液,设3块96孔培养板,10孔平行对照组,于37℃,5%CO2培养箱内培养。1天、2天、4天后在倒置显微镜下观察两种细胞的生长情况,通过MTS法测定HUVEC细胞的吸光度OD值,计算出不同浓度组HUVEC细胞的存活率。研究结果:在HBC浸提液L929细胞毒性实验中,25%、50%和75%、100%浓度的浸提培养液组及阴性对照组细胞死亡情况较苯酚阳性对照组有显著差异(P<0.001),HBC浸提液可明显抑制L929细胞的生长,促进其凋亡。流式细胞学检测:HBC浸提液可以将L929细胞部分阻碍在G1期向S期分化过程中(P<0.05),验证了其凋亡存在性。HBC浸提液对HUVEC无细胞毒性,且100%浸提液对于HUVEC细胞较阴性对照组有轻度促进生长作用(P<0.001)。通过观察发现第4天HLF细胞也出现了与L929细胞相似的凋亡细胞学形态。结论:温敏性羟丁基壳聚糖(hbc)未发现明显的细胞毒性,可促进血管内皮细胞的生长,但对成纤维细胞有一定的抑制作用。第二部分温敏性羟丁基壳聚糖生物安全性研究动物实验研究目的:本研究使用羟丁基壳聚糖(hbc),研制出一种新型可原位注射、温敏性凝胶系统。通过动物体内急性毒性实验、致热原实验、皮内刺激实验、免疫毒性实验等,初步评价该材料的生物安全性,为材料的最终临床应用提供动物实验依据。研究方法:1.急性毒性实验将hbc水凝胶在生理盐水下浸提24小时后,滤去沉淀,得到hbc生理盐水浸提液。将清洁级健康sd大鼠随机分为实验组及对照组,每组各5只,通过尾缘静脉以0.1ml/s的速度、50ml/kg的剂量注射入实验组大鼠体内,观察大鼠死亡情况。2.致热原实验通过耳缘静脉将上述hbc生理盐水浸提液以0.1ml/s的速度、2.5ml/kg的剂量注射入7只清洁级新西兰兔体内后,观察体温变化情况。3.皮内刺激实验将4种不同的待测液(100%hbc浸提液、50%hbc浸提液、生理盐水、苯酚溶液)通过皮内注射入5只清洁级新西兰兔的背部,观察其皮肤改变情况。4.免疫毒性实验将80只大鼠随机分为低、中、高剂量组和对照组,腹腔给药2周,每周2次,恢复周期14天,检测大鼠血清免疫学指标后进行比较。取大鼠股骨骨髓组织,用吉姆萨染液染色后观察骨髓涂片。研究结果:hbc浸提液注入sd大鼠体内一周后未引起大鼠死亡及不适,急性毒性实验结果为阴性。将hbc浸提液注射入新西兰兔体内未引起实验动物体温升高,致热原实验结果为阴性。将hbc浸提液注射入新西兰兔背部皮肤,实验组皮肤刺激反应与阴性生理盐水组相似,无明显皮肤颜色改变,而与阳性对照组有显著性差异。血清免疫学实验中发现免疫球蛋白iga、igg、补体c3、杀伤型(cd3+cd8+)t细胞等检测指标有统计学差异(p值<0.05),其余免疫球蛋白igm、补体c4、cd3+t细胞、辅助型(cd3+cd4+)t细胞等检测指标无统计学差异。说明:羟丁基壳聚糖hbc注入sd大鼠体内后,提高了大鼠机体免疫力。骨髓涂片结果:三组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)大鼠的骨髓涂片和对照组无显著差别,恢复期、无恢复期均未见明显的骨髓增生活跃或骨髓抑制现象。结论:HBC水凝胶动物实验中表现出较好的生物相容性,可增加大鼠机体免疫力,有望成为一种理想的医用生物材料。