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茶黄素(Theaflavins,TFs)是目前茶叶深度开发领域中研究的热点成分,在天然药物、功能食品、日用化工、功能饮料等领域有着广泛的应用前景。但是,红茶中茶黄素的含量非常低,从红茶中提取制备茶黄素,分离纯化难度大且得率低,工业化生产成本高,这严重影响着茶黄素产业化开发的进程及茶黄素的广泛应用。本文在前人研究的基础上,通过摸索最佳反应条件,选用不同的酶源和底物,采用生物酶促氧化的方法制取含量较高的茶黄素粗品,旨在为茶黄素的提取分离与纯化提供高含量的基料。本研究首次使用的苹果和梨子作为多酚氧化酶(PPO)的酶源来制取茶黄素,取得了很好的效果,为茶黄素的酶促氧化制备提供了一条新的高效途径。 反应条件的优化研究表明,在本试验的反应体积下,茶黄素酶促合成的最佳条件为:温度为30℃,反应体系的最佳pH值为4.8,底物浓度为0.9g/100ml,酶浓度为28g/100ml(以鲜叶重量计),通氧量为0.41/min。温度和pH值是反应体系中两个重要的影响因素(P<0.05)。 PPO酶源筛选研究表明,在供试的酶源中,对茶黄素的形成与积累的效果依次为:梨子>茶叶>苹果>微生物(1号,多孔菌,Polyporus;2号,毛栓菌,Trametes trigii;3号和4号是作者分离纯化得到,属于尚未鉴定的霉菌类)。利用梨子PPO制取茶黄素,其含量高达45.727%,制率也高达41.11%。而在供试的茶鲜叶中,苹云较好,槠叶齐次之,在以苹云冷冻叶为酶源制取的茶黄素含量达33.737%,制率达42.22%,非冷冻叶的茶黄素达14.5%,制率为72.22%。在自选微生物菌种中,自选4号>3号>2号和1号。 不同底物的筛选试验研究表明,在本试验条件下,高EGC的儿茶素氧化效果最好。小叶种儿茶素比大叶种儿茶素的效果要好。 双液相试验研究表明,不同的酶源对双液相体系的试验效果不同,就茶鲜叶而言,采用双液相效果明显比单液相显著。在双液相系统中,非冷冻叶制取茶黄素其总含量达49.308%,制率为59.44%。而对苹果和梨子而言,单液相比双液相要效果好些。 不同缓冲液试验研究表明,在利用茶鲜叶制取茶黄素时,从TFs含量来看,乙酸—乙酸钠缓冲液要比柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液好些,但从得率来看,前者比后者要低。