[背景]成年神经新生是指在胚胎和出生早期发育停止后仍不断有新的神经细胞产生、并整合至已经存在的神经回路中的现象。成年神经新生在哺乳类动物的嗅脑和海马这两个脑区最为活跃。成年动物海马齿状回的新生神经元参与学习、记忆的形成和消退,并且与情绪的调节有关。该部位的成年神经新生受到多种生理和病理因素的影响。颞叶癫痫是成年患者中最为常见的癫痫类型,其中30%-40%患者的痫性发作不能以现有的药物进行有效的控制。痫性活动,特别是癫痫持续状态(status epilepticus, SE)短暂增强海马齿状回颗粒细胞新生。依据SE后新生颗粒细胞胞体迁移的位置可将它们分为正常位置迁移颗粒细胞和异位迁移颗粒细胞。大部分异位迁移颗粒细胞胞体位于门区,少数位于分子层。与已经存在的颗粒细胞相比,门区异位颗粒细胞带有底树突的比例增加、静息膜电位去极化、部分细胞具有产生自发／爆发性放电的能力以及接受相对较强的兴奋性投射,被认为有助于癫痫的形成以及癫痫波的扩散。尽管SE后迁移到正常位置的新生颗粒细胞在数量上远远多于异位颗粒细胞,但由于研究方法的限制,至今对它们的认识较少。以往的研究多是在未成熟颗粒细胞进行的,而且仅有的电生理学研究并未发现SE后正常分布新生颗粒细胞具有高兴奋性。活性调节细胞骨架相关蛋白(activity-regulated cytoskeleton-associated protein, Arc)基因是一种即早基因。有充足的证据表明,无论是在mRNA还是蛋白水平上的Arc表达改变都可用于反映神经元的活动强度。本课题应用携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)基因的逆转录病毒载体标记新生颗粒细胞,结合共聚焦显微成像、脑片膜片钳记录以及Arc免疫荧光染色,分析了SE后新生、正常分布的海马齿状回颗粒细胞在发育成熟后的树突形态、树突棘密度、电生理学性质以及在癫痫发作间期和癫痫发作期的细胞活动水平。[主要方法]1.SE的诱导取体重为150-175g的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,称重后,腹腔内注射东莨菪碱/特布他林溶液(各2 mg/kg)。半小时后,按340 mg/kg的剂量腹腔内注射匹罗卡品溶液诱导SE。对照组动物注射相应容积的生理盐水。保留Racine癫痫发作分级Ⅱ级或高于Ⅱ级、发作时间持续2小时以上的动物进行后续实验。2.逆转录病毒载体的构建将pCMV-VSV-G和pCAG-GFP两种质粒同时转染至Platinum-GP细胞,分别于48和72小时后收集上清液,以超速离心分离、浓缩病毒。随后,以浓缩病毒感染Platinum-E细胞系构建能够稳定产生CAG-GFP逆转录病毒载体的稳转细胞系。在对稳转细胞进行培养后,定期收集上清液,以超速离心法浓缩纯化病毒载体。将浓缩后的CAG-GFP逆转录病毒载体储藏于-80度保存、备用。3. CAG-GFP逆转录病毒载体的齿状回内注射在SE诱导后第5天,腹腔内注射苯巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠,将动物固定于小动物脑立体定位仪上。对头部进行消毒后,切开皮肤和皮下组织、暴露颅骨。在前囟后3.2 mm、中线右侧2.5 mm处,以颅骨钻钻孔,去除小块颅骨、硬脑膜,插入1微升进样针,进针深度为2.4 mm。将1μl病毒载体,以0.1μl/min的速度注射到海马齿状回中。注射完毕后,将针头停在原位15分钟以防止溶液沿针孔回流。随后缓慢退出微量进样针,缝合切口。待大鼠苏醒后将其转移回鼠笼中。4.经心脏灌流固定和海马组织切片的制作病毒载体脑内注射至少10周后,腹腔内注射苯巴比妥钠麻醉动物,以2%多聚甲醛溶液经心脏对脑进行灌流固定。将取出的脑组织置于2%多聚甲醛溶液中在4℃下固定过夜。经梯度沉糖脱水后,以卵白蛋白-明胶-戊二醛混合物包埋含海马的脑组织块。根据实验需要,将包埋后的脑组织用振荡式切片机薄切至100μm或40μm备用。5.树突复杂性以及树突棘密度的定量分析对厚度为100μm、含有GFP阳性细胞的切片,先以兔抗GFP抗体进行免疫荧光染色加强GFP荧光。使用下列参数对GFP阳性细胞进行三维序列扫描：20倍物镜、Zoom为1、扫描间隔为2μm。树突复杂性以Sholl法(Sholl analysis)进行定量分析。首先以三维序列扫描文件重建细胞的三维图像,然后用‘’ImageJ软件描画出除轴突外的整个胞体和突起的轮廓,用描画后的细胞图像进行Sholl分析。所有被分析细胞均位于齿状回上锥体片。每只动物至少扫描3个细胞,以这些细胞所得数据的均值代表单个动物颗粒细胞树突复杂性。对用于树突棘密度分析的细胞选择63X物镜进行三维序列扫捕,Zoom扫描间隔分别为4.0和0.12μm,扫描部位为位于中分子层的树突中段和外分子层的树突末段。对每只动物,选中段和末段树突各9段进行扫描和定量分析。以三维序列扫描文件建立树突三维图像,用Image J软件人工计数总的树突棘和蘑菇状树突棘。用树突数除以相应的树突长度计算树突棘密度,表示为树突棘数μm。以9段树突段所得密度的均值代表个体动物的树突棘密度。6.脑片膜片钳记录逆转录病毒载体注射至少10周后,用乙醚麻醉动物,快速断头、取脑,在低温下制成组织块并将其固定于切片槽底部。用振荡切片机制作厚度为410μm的矢状脑片。将制备好的脑片用预先加温至34.5℃、95%O2/5%CO2-饱和的人工脑脊液孵育30分钟后,转移到室温、持续氧和的人工脑脊液中孵育、备用。将单一脑片置于灌流槽底部,以95% O2/5%CO2-饱和的人工脑脊液持续灌流脑片。以普通荧光照射(X40水镜头)齿状回部位,寻找GFP阳性细胞。发现GFP阳性细胞后,即切换到相差模式下观察,并用CCD相机将细胞图像实时显示在计算机屏幕上,然后在室温下进行膜片钳记录。记录的参数包括自发和诱发放电、微小兴奋性突触后电流(mEPSC)和微小抑制性突触后电流(mIPSC)。7.戊四氮(PTZ)诱导急性癫痫发作以及Arc的免疫荧光强度比较逆转录病毒载体注射至少10周后,腹腔内注射PTZ (20 mg/kg)诱导癫痫发作,对照组动物给予等体积/体重的生理盐水注射。癫痫发作15分钟后,腹腔内注射地西泮(5 mg/kg)予以终止。地两泮注射2小时后,以2%多聚甲醛经心脏对脑进行灌流固定、取脑。随后,将脑组织在同样浓度的多聚甲醛溶液中固定过夜后,梯度沉糖、脱水,用振荡切片机制作厚度为40μm的冠状面脑片。用PBS清洗后,将脑片置于封闭液中在4℃下封闭2.5小时。随后将脑片转移至兔抗Arc抗体溶液(用封闭液稀释1000倍)中4℃孵育过夜。第二天,用PBS清洗后,将脑片置于Alexa Flour 488标识的驴抗兔二抗溶液中在4℃下孵育2.5小时。洗片后,将脑片置于载玻片上,用含有75%甘油的PBS溶液封片。对含有GFP阳性新生细胞、经Arc免疫荧光染色后的脑片以共聚焦显微镜在40倍镜下进行层扫描(Zoom=1.0)。应用ImageJ软件分别对GFP阳性细胞胞体和GFP阳性细胞周围10个GFP阴性颗粒细胞胞体的Arc荧光强度进行测定。计算同一张切片中GFP阳性细胞Arc荧光强度值和周围GFP阴性细胞Arc荧光强度均值的比值,以此比值来评价成熟的新生颗粒细胞和已经存在颗粒细胞的活动强度。[主要结果]1. CAG-GFP逆转录病毒载体标识新生颗粒细胞的有效性载体注射1 0周后,在对照组动物和癫痫模型组动物都可观察到胞体位于颗粒细胞层、树突形态完整、树突末梢到达外分子层的表达GFP的新生颗粒细胞。在癫痫模型组动物,GFP阳性细胞较为稀疏,部分GFP阳性细胞带有向门区走行的底树突。2.癫痫组与对照组动物新生颗粒细胞成熟后树突复杂性和树突棘密度的比较癫痫组与对照组动物相比,两组动物新生颗粒细胞的树突复杂性没有显著性差异。树突棘定量分析发现在中段树突,两组动物的总树突棘和蘑菇状树突棘密度相似,但SE组动物末段树突的蘑菇状树突棘密度较对照动物显著增加。3.癫痫组与对照组动物新生颗粒细胞成熟后电生理学性质的比较无论是在癫痫模型组动物还是在对照组动物,成熟后的新生颗粒细胞在接近静息膜电位水平均没有表现出具有持续自发放电的能力。癫痫组动物和对照组动物分别有17.6%(3/17)和11.76%(2/17)的成熟颗粒细胞出现短暂的自发放电(P>1.0)。对照组动物和癫痫组动物成熟颗粒细胞的静息膜电位水平分别为-76.0±1.1 mV(n=6)和-75.8 mV±0.9 mV(n=6),两组之间没有统计学差异。细胞内注射电流诱发的动作电位参数包括动作电位阈值、幅度、宽度、后去极化电位的幅度和面积在两组之间也没有显著的统计学差异。在-70 mV,两组动物的mIPSC无论在频率、幅度、上升时间、衰减时间以及曲线下而积等方面均无显著统计学差异。但与对照组动物相比,癫痫组成熟颗粒细胞的mEPSC的幅度较对照组小,而且频率也有降低的趋势。4.癫痫组与对照组动物新生颗粒细胞成熟后在癫痫发作间期和癫痫活动期细胞活动强度的比较1)在未经PTZ诱导的对照动物,Arc整体表达水平较低,但成熟后的正常迁移新生颗粒细胞与周围颗粒细胞相比,Arc表达量稍高。2)未经PTZ诱导的癫痫组动物,成熟的癫痫持续状态后新生颗粒细胞与周围已经存在颗粒细胞相比,Arc表达量极为接近。3)在经PTZ诱导的对照组动物,痫性活动显著增加Arc蛋白的表达,但与已存在颗粒细胞相比,成熟后的新生颗粒细胞Arc表达量偏低。在给予PTZ诱导的有自发癫痫的动物,这一趋势没有出现显著改变。统计结果表明,无论是在癫痫发作期还是发作间期,成熟的癫痫持续状态后新生颗粒细胞的活动度与周围颗粒细胞相比并没有差异。[结论]癫痫持续状态后正常迁移的新生颗粒细胞成熟后与生理条件下新生的同龄颗粒细胞相比,终末段树突蘑菇状棘密度较高,但微小兴奋性突触后电流的幅度较低,其它参数包括树突复杂性、抑制性突触传递以及癫痫发作间期和癫痫发作期的细胞活动性均无显著性差异。以上结果提示癫痫持续状态后短暂的神经新生增强难以维持齿状回处于高兴奋性状态。